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| 問題一:陰性對照出現(xiàn)陽性結果 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 試劑/樣品污染 | 試劑和樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑，小心操作移液器 |
| 夾心ELISA-檢測抗體與包被抗體反應 | 確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體，他們之間不會相互反應 |
| 酶標板洗板不* | 用洗液充滿板空確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈 |
| 抗體量過多導致非特異性結合 | 根據(jù)推薦用量使用抗體盡量使用較少的抗體 |
| 問題二：酶標板整體背景高 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 結合反應太強或時間過長 | 檢查底物的稀釋，使用建議的稀釋度。當酶標儀顯色足夠進行吸光度讀取是立即用終止液終止反應 |
| 底物溶液或終止液不是新鮮配制的 | 使用新鮮配制的底物溶液。終止液應該是清亮的（如果它變黃，這是被污染的標志，需要重新配制） |
| 沒有終止反應 | 如果底物反應沒有被終止，顏色會繼續(xù)變化 |
| 酶標板在酶標儀度板前放置時間過長 | 顏色會繼續(xù)變化（盡管加了終止液，依然會以很慢的速度變化） |
| 實驗器皿污染 | 確保試劑是新鮮配制的并且使用的是清潔的玻璃器皿 |
| 底物孵育過程沒有曝光 | 底物孵育應該在避光條件下進行 |
| 孵育溫度過高 | 抗體在適宜的溫度下有*的結合活性。確保孵育在正確的溫度下進行，孵育箱要設定好溫度并正常工作，孵育溫度可能需要一些優(yōu)化 |
| 抗體非特異性結合 | 確保進行了封閉并使用的是恰當?shù)姆忾]液。我們建議使用5-10%的與二抗同種動物來源的血清或牛血清。確保孔板進過預處理以防止非特異性結合。使用親和力強、純度高的抗體，經(jīng)過了預吸收 |
| 問題三：吸光度數(shù)值低 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 使用的樣品中沒有顯示靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低 | 檢查靶蛋白表達系統(tǒng)，確保它在您的樣品中被表達出來。如果靶蛋白的表達水平低，需要增加樣品使用量，或者您可能需要選擇一個更加靈敏的檢測方法。確保您使用的是沒有超過測定方法檢測范圍的陽性對照 |
| 抗體不足 | 確定使用的是建議的抗體量，為了使結果更好可能需要增加抗體的濃度 |
| 底物溶液不是新鮮配制或成分有誤 | 使用新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內(nèi)并且正確保存，使用的濃度也是正確的，確保試劑按正確的濃度使用 |
| 試劑不是新鮮配制或pH值有誤 | 確保試劑配制正確并在有效期內(nèi) |
| 孵育時間不夠長 | 如果建議了孵育時間，確保按推薦的時間長度孵育抗體。為了使結果更理想，孵育時間可能需要增加 |
| 孵育溫度太低 | 抗體在適宜的溫度下有*的結合活性，確保孵育時在正確的溫度下進行，孵育箱要設定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優(yōu)化。確保所有的試劑在使用前是室溫 |
| 未加終止液 | 加入終止液可以增加顯色反應的強度，也能固定反應zui終的顏色 |
| 問題四：吸光值高 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 樣品和/或陽性對照吸光度數(shù)高。吸光度沒有按樣品在板上的稀釋梯度遞減 | 樣品或陽性對照的濃度過高，超出了實驗方法檢測的范圍。重新設置實驗方法或者在加樣前稀釋降低樣品和對照的濃度，在處理結果計算濃度時考慮到所作的稀釋 |
| 問題五：酶標板上吸光度不規(guī)律 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 孵育時酶標板疊在一起 | 酶標板疊在一起使板子每個孔的溫度不能平衡一致，請避免堆積 |
| 吸液不一致 | 確保移液器使用正確并進過校準、確保槍頭差的足夠緊密。板子稀釋時要特別仔細，注意確保每個槍頭都吸上和排除正確量的液體，這對平行樣品結果的一致性有很大影響 |
| 抗體稀釋液/試劑 | 為保證板子所有孔的濃度一致，確保所有的試劑和樣品在加到板子上以前都被均勻混合 |
| 孔板變干涸 | 確保所有孵育期間酶標板始終被蓋好。放置一個潮濕的水盤（確保清潔，無菌水）在孵育箱底部 |
| 洗板不充分 | 這將導致一些孔沒有其他孔清潔的好，殘留不同量的未結合的抗體，使后面的結果產(chǎn)生不一致 |
| 酶標板底部不凈影響吸光度讀取 | 讀板前小心清潔酶標板底部 |
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