IHC Trouble Shooting

更新時間：2018-03-26 點擊次數：2047

問題一：缺乏染色
可能的原因	檢測方法和相應的措施
沒有抗原	用原位雜交的方法檢測蛋白表達（有時即使能檢測到mRNA。翻譯也有可能受阻）
由于錯誤的儲存方法	按照說明書儲存。通常，將抗體按照足夠配制單次實驗工作溶液的體積分裝。儲存在手動除霜冰箱中（-20到-70℃），避免反復凍融
無效的一抗或二抗	單獨檢查報告系統以評估試劑的有效性。
固定不充分	嘗試增加固定時間或改用不同的固定劑
過度固定	減少浸潤或固定后步驟的時間。如果必須使用浸潤法固定（例如病理實驗室中的尸檢組織或切片），可以用抗原修復試劑修復被遮蔽的表位
不兼容的二抗和一抗	使用可以與一抗結合的二抗。例如，如果一抗是兔源的，則使用抗兔的二抗
在與一抗孵育前抗原被破壞	如果內源性過氧化物酶的封閉是在加入一抗前進行的，則改為加入一抗之后在封閉
在固定或包埋過程中表位發生改變	嘗試使用不同的抗原修復技術修復免疫反應性。在58℃以下包埋組織。
抗原修復無效	增加修復時間或更換修復液
漏用試劑或未按正確的順序加入試劑	重復染色并確定使用的試劑和加入的順序正確

問題二：高背景
可能的原因	檢測方法和相應的措施
一抗或二抗的濃度過高	對抗體進行滴定以確定獲得特異性反應的*濃度
抗體和組織中蛋白的疏水相互作用	降低抗體稀釋液的離子強度（降低鹽濃度對單克隆抗體尤其有效）
一抗和/或二級試劑與組織的非特異性結合	一抗孵育前進行封閉（我們用1%的牛血清蛋白或者10%的正常驢血清，也可以使用脫脂奶粉）
二抗的非特異性結合	使用去除了交叉反應性IgG的抗體（針對樣品目標種屬去除）
組織過于干燥	在染色過程中避免組織干燥
試劑粘附在舊的或未制備好的玻片上	用新鮮制備或購買的玻片進行實驗
由于離子相互作用造成的背景	增加稀釋緩沖液的離子強度

問題三：細胞/組織的形態被破壞
可能的原因	檢測方法和相應措施
抗原修復方法過于激烈	在抗原修復的時候根據經驗確定合適的條件以保持組織形態
組織切片從玻片上脫落（更常見于冰凍切片）	增加固定時間。根據經驗增加額外的或更換固定劑。使用新鮮準備的，帶有充足電荷的玻片
組織切片撕裂或皺褶。切片下有氣泡	使用鋒利的刀片重新切片或者在分析結果的時候忽略受損的區域
組織形態難以分辨	切片的時候切得薄些。冰晶有可能破壞冰凍切片的形態
固定不充分的組織或細胞在染色時可能遭到破壞	增加固定時間和/或進行二次固定。提高固定劑/組織的比例。將組織切的較小以獲得更*的浸潤固定
組織的自發裂解產生很多染色的壞死碎片	增加固定時間，比率。考慮使用交聯性固定劑