Forskolin的功能與作用

 

  Forskolin可以使膜，細(xì)胞或組織制備液中cAMP含量上升。Forskolin 不僅可以活化AC 而且可以與某些其它蛋白相互作用，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和離子通道。Forskolin能夠促進(jìn)9種不同獨(dú)立AC形式的活化，雖然對(duì)AC9效率有點(diǎn)低，這可以用于提供一種鑒定和量化G蛋白 (Gs)–AC復(fù)合物高親和性結(jié)合位點(diǎn)的方法。G蛋白偶聯(lián)受體活化G蛋白有助于細(xì)胞中Forskolin刺激的cAMP 產(chǎn)生，因?yàn)?G蛋白-Forskolin對(duì)AC活性有增強(qiáng)作用。

 

  Forskolin的細(xì)胞內(nèi)濃度由兩個(gè)細(xì)胞膜上的酶調(diào)節(jié)，促進(jìn) ATP 合成 cAMP， 而磷酸二酯酶把 cAMP 降解成 AMP。cAMP 的激活是由不同的 GTP 結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體受體（GPCR）和 GTP 結(jié)合蛋白（Gs 或者 Gi）相互 作用而調(diào)節(jié)。蛋白是由 Gα （i 或者 s） 、Gβ 和 Gr 組成的異源三聚體GPCR 激動(dòng)劑使 GTP 和 Gα 結(jié)合，產(chǎn)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致 Gα 與 Gβ γ 分離.分離后，Gα s 主要與 AC 激活有關(guān)，而 G α i 則是抑制 AC 活性。測(cè)量胞內(nèi) cAMP 是檢測(cè)化合物對(duì) GPCR 介導(dǎo)的 AC 活性的激活或者抑 制作用的理想方法。細(xì)胞制備，細(xì)胞長(zhǎng)到 70%的時(shí)候， 用不含鈣和鎂離子的 PBS 洗一次， 然后用 5mM EDTA(PBS 配制成的)37 度消化 5min，275g 離心 10min.HBSS 1X 重懸，計(jì)數(shù)，275g 離心 5min.用 stimulation buffer 重懸細(xì)胞，按 6*105 個(gè)/ml 的濃度稀釋細(xì)胞（3000/孔） 分析步驟 1 Gα s 受體分析 cAMP 標(biāo)曲 Gα i 受體分析 cAMP 標(biāo)曲 目的 確定 cAMP 分析的敏感性 （IC50 值）和動(dòng)態(tài)范圍 （IC10-IC90） 。確定zui大分析窗的*細(xì)胞 濃度，對(duì)于 Gα i 分析，確定 Forskolin 的 EC90 以用于激動(dòng) 劑分析。