WB疑難雜癥——膜蛋白

什么是膜蛋白？

膜蛋白是細胞膜的重要組成部分，負責許多關鍵的生物學功能如物質運輸、信號轉導和細胞間識別等，人類基因組中編碼的膜蛋白約占總蛋白質組的25%左右。它們可以根據其與膜的結合方式和功能特點被分為不同的類別。以下是膜蛋白的一些主要類型和功能：

1、膜蛋白分類

外在膜蛋白：這些蛋白分布在細胞膜的內外表面，約占膜蛋白的20%-30%，主要在內表面。它們通過離子鍵、氫鍵與膜脂分子的極性頭部相結合，或通過與內在蛋白的相互作用，間接與膜結合，大多是親水性蛋白，主要的類型有酶類、受體蛋白、細胞骨架相關蛋白、免疫相關蛋白、細胞間連接蛋白等。

內在膜蛋白：這些蛋白約占膜蛋白的70%～80%，是雙親媒性分子，可以不同程度地嵌入脂雙層分子中。有些貫穿整個脂雙層，兩端暴露于膜的內外表面，這種類型的膜蛋白也稱為跨膜蛋白，包括跨膜離子通道蛋白、G蛋白偶聯受體(GPCR)、跨膜轉運蛋白、跨膜受體酪氨酸激酶(RTKs)等。

脂錨定膜蛋白：這類蛋白通過與之共價相連的脂分子插入膜的脂雙分子中，從而錨定在細胞質膜上。

2、研究膜蛋白有什么意義？

疾病治療：膜蛋白在許多生理過程中起著至關重要的作用，包括細胞信號轉導、物質運輸和細胞識別等。許多疾病，如囊性纖維化、糖尿病、心血管疾病和神經退行性疾病，都與膜蛋白的功能異常有關。研究膜蛋白有助于理解這些疾病的發病機制，并為開發新的治療方法提供靶點。

藥物開發：大約60%的藥物作用于膜蛋白，如G蛋白偶聯受體(GPCRs)、離子通道和轉運蛋白。通過研究這些膜蛋白的結構和功能，科學家可以設計出更有效的藥物來調節它們的活性，從而治療相關疾病。

生物醫學研究：膜蛋白在細胞間的通訊、細胞對外界信號的響應以及細胞的免疫功能中扮演關鍵角色。這些研究有助于我們理解細胞如何感知和適應環境變化，以及如何在細胞層面上調控生物過程。

生物膜結構的理解：細胞膜的結構和動態性質對于細胞的生存至關重要。研究膜蛋白如何與膜脂質相互作用，可以幫助我們更好地理解生物膜的物理性質和生物物理學。

生物技術應用：膜蛋白的研究可以促進生物技術的發展，例如在生物傳感器、藥物篩選和納米技術等領域。了解膜蛋白的特性可以幫助設計出更有效的生物技術工具。

細胞生物學的基礎研究：膜蛋白是細胞膜的主要組成部分，研究它們有助于我們理解細胞膜的生物合成、維持和修復等基本細胞過程。

農業和畜牧業：在農業和畜牧業中，膜蛋白的研究有助于改良作物和家畜的性狀，例如通過基因工程改變植物的膜蛋白來提高其對疾病的抵抗力或改善其營養價值。

環境科學：在環境科學領域，膜蛋白的研究有助于理解微生物如何與環境相互作用，例如在生物修復和污染物的代謝過程中。

3、如何知道自己研究的蛋白是不是膜蛋白？

可以通過uniprot進行亞細胞定位預測，方法很簡單，只需要輸入蛋白名稱，選擇相應的物種，進入詳情頁面。

選擇亞細胞定位即可了解該蛋白在細胞中的分布情況。

當然，也可以通過YLoc、Cell-PLoc等工具進行相互驗證。

4、膜蛋白WB難在哪？

膜蛋白有很多屬于大分子量蛋白，比起小分子量蛋白，提取和轉膜更加困難。

提取困難：膜蛋白與膜結合緊密，不易從膜上洗滌下來，特別是跨膜蛋白，具有：

1）結構復雜：跨膜蛋白擁有多重跨膜結構域，通過疏水作用緊密地嵌入到細胞膜中，這使得它們在水中的溶解度非常低，不易被提取。

2）表達量低：膜蛋白在樣品中的表達量通常不高，如果不富集，在總蛋白中占比較低，用總蛋白檢測時，可能無法檢測到。

3）易形成多聚體：膜蛋白由于其跨膜區域的疏水性，加熱時疏水相互作用可能會增強，導致膜蛋白分子間相互聚集，形成聚合物。

4）分子量大：部分膜蛋白分子量較大，大分子量蛋白WB，電泳，轉膜等條件需要摸索，較為困難。

面對膜蛋白我們應該如何處理？

1、了解自己研究蛋白的特性

可以通過uniprot、topcons、The Human Protein Atlas等工具，結合文獻檢索，了解研究蛋白的在組織及各種細胞中的表達量、是否屬于跨膜蛋白等，表達量較高且不屬于跨膜蛋白的，蛋白相對好提取，可以用總蛋白提取方式，對于跨膜蛋白或者表達量相對較少，不好提取的蛋白，可以先進行膜蛋白富集(abs9346-50T)。

abs9346-50T 細胞漿、細胞核及細胞膜蛋白抽提試劑盒

2、蛋白變性

為了避免膜蛋白熱變性收到溫度影響產生多聚體，影響實驗結果，建議建議根據蛋白具體屬性在50-70℃左右進行熱變性或者采用37℃。

3、電泳

分離膠的選擇

根據蛋白分子量大小選擇凝膠濃度，需要同時分離分子量跨度較大的多種蛋白，也可以選擇梯度膠，大分子蛋白最好使用 Tris-Acetate體系進行電泳，absin的Tris-Acetate預制膠能夠有效分離40-500kDa的大蛋白分子，采用玻璃膠板，有效減少蛋白非特異性吸附，使蛋白條帶更為尖銳，清晰。電泳時，可采用120-150V的高電壓，在冰水浴中進行，盡量使Marker拉開足夠大的距離，通常需要4小時左右。

4、轉膜

轉印膜的選擇

濕轉法轉膜時間長，300mA電流條件下，150-180KDa的蛋白需要3-3.5h，180-250KDa需要4-5h，大于250KDa需要5.5-6h，濕轉法通常效果比較好，比較推薦。半干轉，40V恒壓，轉膜60-90min，小于400KDa的蛋白一般都能轉到PVDF膜上。恒流法轉，電流大小設置為PVDF膜的面積，時間1小時左右，半干轉節約時間。

其他問題可根據實際實驗調整。

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