抗體/蛋白標(biāo)記染料選擇指南及常見(jiàn)問(wèn)題解答

在當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，精準(zhǔn)、高效地識(shí)別和追蹤目標(biāo)分子是解鎖疾病機(jī)制、開發(fā)新型藥物以及推動(dòng)個(gè)性化醫(yī)療的關(guān)鍵。抗體/蛋白標(biāo)記技術(shù)作為一種強(qiáng)大的工具，在這一過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用。通過(guò)將特定的化學(xué)標(biāo)簽（如熒光染料、酶或放射性同位素）與抗體或蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，研究人員能夠以更高的靈敏度和特異性對(duì)復(fù)雜生物系統(tǒng)中的目標(biāo)分子進(jìn)行可視化和定量分析。

常見(jiàn)抗體/蛋白標(biāo)記技術(shù)

熒光素標(biāo)記：使用熒光素如Alexa Fluor系列（AF488\AF594\AF647等）、Cy系列（Cy3\Cy5\Cy7等）、FITC等與抗體或蛋白結(jié)合，常用于流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光和活體成像等實(shí)驗(yàn)；

酶標(biāo)記：如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記，通過(guò)催化底物生成有色產(chǎn)物或化學(xué)發(fā)光，用于ELISA、Western Blot、免疫組化等實(shí)驗(yàn)；

生物素標(biāo)記：生物素(Biotin)標(biāo)記法是利用生物素與抗體或蛋白等生物大分子的氨基結(jié)合，廣泛應(yīng)用于微量抗原、抗體定性、定量檢測(cè)及定位觀察研究。

一、Alexa Fluor系列染料概述

Alexa Fluor染料是羅丹明等染料的衍生物，利用磺酸或磺酸鹽代替羅丹明等染料中的氫原子合成。主要應(yīng)用于生物研究中對(duì)組織、細(xì)胞和生物分子的標(biāo)記和定位。標(biāo)記抗體和蛋白的Alexa Fluor系列染料其發(fā)射光譜、激發(fā)光譜、常用的激發(fā)光和等效染料如表1所示。其中較常用的是綠色熒光探針Alexa Fluor 488。與絕大部分常用的綠色熒光探針相比，Alexa Fluor 488更加明亮，不容易熒光猝滅，背景更低。

表1 常用標(biāo)記抗體/蛋白的Alexa Fluor系列染料

抗體/蛋白Alexa Fluor標(biāo)記原理及優(yōu)勢(shì)

Alexa Fluor標(biāo)記利用了高效和簡(jiǎn)單的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯化學(xué)反應(yīng)，選擇性地將Alexa Fluor染料與鄰近蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)（-NH₂，包括賴氨酸側(cè)鏈和氨基端）相連接，共價(jià)結(jié)合形成一個(gè)穩(wěn)定的琥珀酰亞胺酯結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 NHS酯反應(yīng)示意圖

R表示具有NHS酯反應(yīng)基團(tuán)的標(biāo)記試劑或交聯(lián)劑的一端；P表示含有伯胺(-NH₂)的蛋白分子

Alexa Fluor系列染料具有以下優(yōu)勢(shì)：

①發(fā)射光譜窄。相較于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料，Alexa Fluor染料具有較窄的發(fā)射光譜，從而降低不同檢測(cè)的交叉水平；

②熒光強(qiáng)度強(qiáng)，光穩(wěn)定性好；

③受溫度和pH的影響較小；

④具有良好的水溶性。無(wú)需有機(jī)試劑Alexa Fluor染料即可結(jié)合蛋白質(zhì)，且儲(chǔ)存不易產(chǎn)生沉淀；

⑤Alexa Fluor系列染料具有不同的顏色，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用不同Alexa Fluor染料標(biāo)記不同的對(duì)象，從而實(shí)現(xiàn)區(qū)分。

二、Cy系列染料概述

Cy是花菁(Cyanine)的縮寫，也叫菁染料。Cy染料性能優(yōu)良，摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的。通常情況下，根據(jù)需要標(biāo)記的生物分子可標(biāo)記基團(tuán)（如胺基、醛基或巰基）以及酸堿性，選擇相應(yīng)的活化（NHS酯、羧酸基團(tuán)、異硫氰酸酯、馬來(lái)酰亞胺等）染料和反應(yīng)條件 。其NHS酯是較常用的脂肪氨基標(biāo)記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測(cè)。其中菁染料Cy3和Cy5 已成為基因芯片的選擇熒光標(biāo)記物；另外，Cy5、Cy5.5和Cy7的吸收在近紅外區(qū)背景非常低，是熒光強(qiáng)度最高、且穩(wěn)定的長(zhǎng)波長(zhǎng)染料，特別適合于活體小動(dòng)物體內(nèi)成像代替放射性元素（圖2）。

圖2 Cy3(左)，Cy5(中)和Cy7(右)染料的最大吸光度(虛線)和發(fā)射光(陰影區(qū)域)

Cy系列染料的優(yōu)點(diǎn)：

①光譜窄，信號(hào)強(qiáng)，靈敏度高；

②染料的摩爾吸光系數(shù)高于其他熒光染料；

③染料細(xì)胞毒性小，可用于標(biāo)記抗體、蛋白、細(xì)胞；

④熒光波段在近紅外區(qū)段的組織透過(guò)性好，非常適合做小鼠活體成像。

三、HRP和ALP標(biāo)記概述

辣根過(guò)氧化物酶（HRP, Horseradish Peroxidase）和堿性磷酸酶（ALP, Alkaline Phosphatase）是兩種常用的酶標(biāo)記，它們可以與抗體結(jié)合，用于各種免疫學(xué)檢測(cè)方法中，如ELISA、Western blotting、免疫組化等。這些酶標(biāo)記的抗體能夠通過(guò)特定的底物反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，從而幫助定量或定位目標(biāo)抗原。

辣根過(guò)氧化物酶（HRP）特點(diǎn)：HRP是一種非常穩(wěn)定的酶，在廣泛的pH范圍內(nèi)都能保持活性。它催化過(guò)氧化氫（H₂O₂）與某些供氫體之間的反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物或發(fā)光信號(hào)。

應(yīng)用：

①ELISA：在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定中，HRP標(biāo)記的二抗可以用來(lái)檢測(cè)被固定在板上的抗原-一抗復(fù)合物。

②Western Blotting：HRP標(biāo)記的抗體可用于識(shí)別并顯色轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)條帶。

③免疫組化：HRP標(biāo)記抗體用于組織切片中的抗原定位，通過(guò)染色來(lái)觀察細(xì)胞內(nèi)的特定分子。

堿性磷酸酶（ALP）特點(diǎn)：ALP在堿性條件下較活躍，它能去除磷酸根基團(tuán)，將無(wú)色的磷酸酯底物轉(zhuǎn)化為有顏色的產(chǎn)物。相比于HRP，ALP可能對(duì)一些底物顯示出更高的特異性和穩(wěn)定性。在某些情況下，ALP產(chǎn)生的信號(hào)比HRP更持久，這有助于提高低豐度抗原的檢測(cè)能力。

應(yīng)用：

①ELISA：類似于HRP的應(yīng)用，但通常使用不同的底物。

②免疫組化：ALP特別適合用于需要長(zhǎng)時(shí)間染色或保存染色結(jié)果的情況。

③原位雜交：ALP也常用于核酸探針的標(biāo)記，以便在細(xì)胞內(nèi)定位DNA或RNA。

四、生物素標(biāo)記概述

生物素（Biotin）是一種小分子維生素，也稱為維生素H或B7。經(jīng)活化后（Biotin-NHS）可與蛋白/抗體等生物大分子的氨基結(jié)合，不僅可以很好地保持大分子的生物活性，而且與親和素結(jié)合使用時(shí)具有多級(jí)放大作用，使其廣泛應(yīng)用于微量抗原、抗體定性、定量檢測(cè)及定位觀察研究。

在進(jìn)行生物素標(biāo)記時(shí)，需要注意幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：

① 待標(biāo)記物的濃度不應(yīng)過(guò)低，以確保標(biāo)記效率；

② 生物素與待標(biāo)記物的比例要合適，以避免影響待標(biāo)記物的活性；

③ 為了減少空間位阻的影響，可以在生物素與被標(biāo)記物之間加入交聯(lián)臂結(jié)構(gòu)；

④標(biāo)記反應(yīng)后的純化步驟至關(guān)重要，以去除未反應(yīng)的生物素和其它雜質(zhì)。

常見(jiàn)問(wèn)題解答

Q1：蛋白標(biāo)記FITC損耗怎么樣？

A1：損失比較小，有95%以上的收率。

Q2：AF488標(biāo)記抗體的原理？

A2：基于N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯的化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)可以與抗體分子中的伯胺基團(tuán)(-NH2)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，之后脫鹽柱去除游離的染料。

Q3：流式實(shí)驗(yàn)，抗體標(biāo)記推薦什么染料合適？

A3：流式實(shí)驗(yàn)需要純化，不建議PE（收率只有20%左右）和APC標(biāo)記（收率50%左右）可以推薦小分子熒光標(biāo)記，如FITC、AF系列，Cy系列等，標(biāo)記效率很高，可以滿足流式實(shí)驗(yàn)。

Q4：抗體中含有50%的甘油，可以標(biāo)記嗎？

A4：可以，我們會(huì)先進(jìn)行透析，去除甘油后再進(jìn)行標(biāo)記。

Q5：生物素標(biāo)記蛋白，有標(biāo)記效率及COA嗎？

A5：95%以上的標(biāo)記效率，呈正態(tài)分布，蛋白和生物素1:3，按照標(biāo)準(zhǔn)流程標(biāo)記。COA有的，COA里包含濃度，體積和buffer信息。

Q6：標(biāo)記的抗體/蛋白如何保存？

A6：無(wú)論是熒光染料偶聯(lián)抗體、酶偶聯(lián)抗體還是生物素偶聯(lián)抗體，都需要保存在深色瓶?jī)?nèi)，或者包裹上鋁箔紙。收到產(chǎn)品后立即分裝，避免反復(fù)凍融。不要在HRP偶聯(lián)抗體中加入疊氮hua鈉，因?yàn)檫@種保護(hù)劑會(huì)抑制HRP的活性。短期儲(chǔ)存放在4℃（1-2周），如果需要長(zhǎng)期儲(chǔ)存，應(yīng)加入冷凍保護(hù)劑（如甘油）后置于-20℃下保存。

Absin可以提供多種常見(jiàn)熒光素FITC\AF488\AF594\AF647/CY3/CY5/ CY5.5/CY7以及HRP或者生物素的標(biāo)記，體系成熟，目前常規(guī)染料標(biāo)記周期1-2周。

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