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細胞凋亡常見7種檢測方法大匯合

更新時間：2024-09-25 點擊次數：970

提到細胞凋亡，想必大家都不陌生，咱們這個領域的，先不說本科的時候學過，考研的時候怎么說它也是重要考點之一。或許此時您的腦袋瓜子里立馬浮現出課本上那個經典的凋亡信號通路圖......額，還有點記不清......沒關系，今天小編帶您回顧一下經典的細胞凋亡信號通路，再看看它常見的檢測方法。

☆ 細胞凋亡

1）細胞凋亡是一種細胞主動有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用，它并不是病理條件下自體損傷的一種現象，而是為了更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡。

2）細胞凋亡相關信號通路。

凋亡信號通路主要包括Caspase依賴型細胞凋亡和Caspase非依賴型細胞凋亡。

☆ 細胞凋亡常用檢測方法

想要了解凋亡常用的檢測方法，首先要知道凋亡的形態學變化。形態學觀察細胞凋亡的變化是多階段的，細胞凋亡往往涉及多個細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發生的。首先出現的是細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，然后是細胞質密度增加，接下來會發生一系列的變化：線粒體膜電位消失；通透性改變；釋放細胞色素C到胞漿；核質濃縮，核膜核仁破碎；DNA降解成為約180bp-200bp片段，胞膜有小泡狀形成；膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面；胞膜結構仍然完整，最終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內容物外溢。

細胞凋亡檢測通常有形態學觀察方法、DNA凝膠電泳、酶聯免疫吸附法（ELISA)核小體測定、流式細胞儀定量分析、Western blot檢測等。

（1）形態學觀察

電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽"及凋亡小體及凋亡小體被臨近吞噬細胞吞噬現象。

電子顯微鏡觀察Jurkat細胞凋亡過程中核染色質的形態學改變

（2）DNA凝膠電泳

細胞凋亡時主要生物化學特征是其染色質發生濃縮，染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成180~200bp整數倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜（DNA ladder）。通過提取DNA、電泳、UV下可見DNA ladder。此方法是判斷細胞有無凋亡發生的一種簡便方法，比較適用于體外培養的非增殖性細胞的檢測。

泳道1：DNA ladder

泳道2-3：壞死

泳道4-6：凋亡

泳道7：正常細胞

（3）酶聯免疫吸附法（ELISA)核小體測定

凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。

檢測步驟：

① 將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；

② 在微定量板上吸附組蛋白體；

③ 加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合；

④ 加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合；

⑤ 加酶的底物，測光吸收值。

此方法優點：敏感性高、應用廣泛、操作簡單；缺點：不能精確定量。

（4）Annexin V/PI法

正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡細胞中，PS會從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-V（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標記的Annexin-V作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI結合使用，就可以檢測出細胞群體中的早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞。

B3象限：Annexin V-/PI-：活細胞；

B4象限：Annexin V+/PI-：早期凋亡細胞；

B2象限：Annexin V+/PI+：晚期凋亡細胞；

B1象限：Annexin V-/PI+：壞死細胞。

貨號	產品名稱	規格
abs50001	Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒	25T/50T/100T

（5）TUNEL法

細胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。

常用的標記系統：生物素標記的dUTP、熒光素標記的dUTP、溴分子標記的dUTP；

常用的顯色系統：Anti-biotin/digoxin/biotin- HRP和DAB；FITC-dUTP/BrdU和流式細胞儀。

貨號	產品名稱	規格
abs50022	Biotin TUNEL細胞凋亡試劑盒	50T
abs50047	TUNEL細胞凋亡試劑盒（綠色熒光）	20T/50T
abs50058	TUNEL細胞凋亡試劑盒（紅色熒光）	20T/50T

（6）Western blot檢測

分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

（7）熒光分光光度計分析

活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

（8）其他凋亡相關因素分析

1）△Ψm dissipation（線粒體跨膜電位的消失）：TMRM（發紅色熒光），細胞膜熒光探針DiOC6（3），碘化物（發綠色熒光）、Rhodamine 123（發黃綠色熒光）、JC-1（單體形式綠色熒光；多聚體形式紅色熒光）【abs50016-100T：線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)】，這些染料對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。

2）細胞內氧化還原狀態改變的檢測：通過熒光染料Monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細胞細胞質中谷胱甘肽的減少來檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態的變化。

3）檢測線粒體產生的ROS：無熒光的HE（氫化乙啶）可被ROS氧化為EthBr（溴乙啡啶），發紅色熒光。NAO（烷化吖啶橙，可發熒光）能與非氧化的心磷脂（可被ROS氧化）反而失去熒光。

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