線粒體功能障礙 | ATP檢測助力糖尿病心肌缺血-再灌注(MI/R)發病機制研究

2型糖尿病(T2D)是一種全球性威脅，影響著全球數百萬人。T2D是心肌梗死的一個重要風險因素，導致心肌血運重建后嚴重的左心室功能障礙，增加缺血-再灌注(I/R)損傷的風險，并使疾病發展復雜化。糖尿病心肌損傷加重的原因尚待闡明，線粒體功能損傷一直是研究的焦點。

有研究表明T2D增加心肌缺血-再灌注(MI/R)損傷易感性的機制包括：①T2D本身觸發高血糖和胰島素抵抗；②在缺血和再灌注期間誘導的氧化應激和炎癥的釋放。這兩者都導致線粒體功能障礙。盡管越來越多的證據表明線粒體功能障礙與其在T2D MI/R病理生理學中的作用有關，但通過靶向線粒體來對抗這種疾病的有效治療策略尚未實施。

圖1  糖尿病MI/R損傷發病機制研究圖形摘要^[1]

2023年8月3日，武漢大學人民醫院夏中元教授團隊在Cell Communication and Signaling上發表題為“Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA"的研究論文。他們采用高脂飲食(HFD)加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型，心肌缺血2h再灌流30min建立MI/R模型，高糖(HG)和棕櫚酸(PA)誘導H9C2細胞糖脂毒性的細胞模型。研究闡明了cGAS-STING激活在糖尿病MI/R損傷的發病機制中的關鍵作用，該激活是由線粒體融合減少引起的胞漿線粒體DNA增加所觸發的。

圖2  rAAV-MFN2過表達調控糖尿病MI/R小鼠線粒體動力學和功能。C：線粒體形態變化；E-H：心肌細胞總ATP生成量及COX Ⅰ、COX Ⅱ、COX Ⅴ活性^[1]。

夏中元教授團隊的研究結論為糖尿病MI/R損傷的治療提供了臨床前的見解。研究中，心肌細胞總ATP的檢測與定量使用了愛必信（上海）生物科技有限公司提供的ATP Microplate Assay Kit。

ATP檢測試劑盒(abs580117)使用方法介紹

適用范圍：尿液、血清、血漿、組織提取物、細胞裂解物、細胞培養上清和其他生物液體樣品

檢測原理：

三磷酸腺苷(ATP)是細胞代謝的化學能，通常被稱為細胞的“能量貨幣"。ATP只在光合作用和細胞呼吸過程中產生，并在生物合成反應、運動和細胞分裂等細胞過程中消耗。它是細胞活動的關鍵指標，在研究和藥物開發中被用作衡量細胞活性和細胞毒性的指標。

ATP檢測試劑盒是一種靈敏的測定各種樣品中三磷酸腺苷的方法。三磷酸腺苷濃度由肌酸激酶和肌酸決定。反應產物可以在660nm的比色讀數下測量。

備注：

1、反應后溶液應呈現黃色。如果沒有顏色，說明實驗失敗。如果呈藍色，則說明溶液受到污染。為了防止磷污染，最好使用一次性塑料容器來配制溶液。
2、Enzyme：使用前加入1mL蒸餾水溶解。
3、Substrate：使用前加入6mL蒸餾水并加熱至溶解。
4、Standard：使用前加入1mL蒸餾水充分溶解，然后取500μL加入500μL蒸餾水中，獲得濃度為5mmol/L的標準溶液。
5、Dye Reagent Working Solution：分別取5mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅰ中，1mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅱ中充分溶解。將所有Dye Reagent Ⅱ轉移到Dye Reagent Ⅲ中充分混合，然后將所有Dye Reagent Ⅰ轉移到Dye Reagent Ⅲ中（必須遵循這一步驟）。混合的染料試劑可在4℃保存2-3天。

實驗步驟：

一、試劑和材料

1、自備試劑：蒸餾水
2、自備材料：酶標儀、移液器與槍頭、離心管、離心機、計時器、濕冰等。

二、樣品處理

1、細胞/細菌樣品：將細胞或細菌（5×10⁶個）收集到離心管中，離心后去掉上清液，加入1mLAssay buffer，超聲處理（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次），在4℃、8000g下離心10min，將上清液轉移至新的離心管中，置于濕冰上待檢測；
2、組織樣品：稱取1g組織，加入1mL Assay Buffer進行超聲勻漿（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次）后，在4℃、8000g下離心10min，將上清液轉移至新的離心管中，置于濕冰上待檢測；
3、血清/血漿樣品：直接置于濕冰上待檢測。

三、標準曲線制備

用蒸餾水對試劑盒提供的標準品（2.5mmol/L）進行2倍連續稀釋，形成標準曲線。

四、樣品預實驗

對于未知的樣品，濃度可能在很大的范圍內變化。建議多做幾個稀釋梯度進行預實驗，以確保讀數在標準曲線范圍內。

五、樣品檢測

使用前將所有試劑加熱至37℃。按照以下方式加樣并充分反應，最后用酶標儀在660nm下檢測吸光值。

六、樣品濃度計算

樣品濃度計算試劑盒說明書中提供兩種計算方式：①標準曲線法；②公式法。

針對說明書既有計算公式又有標曲的試劑盒，兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法。建議按照標曲計算，雖然比較麻煩且耗費試劑，但檢測結果會更加準確。按照標曲計算，每一次都需要重新做標曲，因為這種反應是一個變化的過程，檢測的數值會隨著反應時間、溫度等產生變化。

圖3  ATP檢測標準曲線示例（檢測限：0.02mmol/L - 2.5mmol/L）

常見問題解答

Q1：我的樣本是組織，按照說明書提供的樣品處理方法收集上清進行檢測，如何確認上清稀釋倍數？

A1：由于待測樣品的ATP含量未知，建議選取合適的樣品點（2-3個）做預實驗以確定稀釋倍數。

Q2：說明書中提到混合后的染料試劑可在4℃ 保存2-3天，我要在2-3天內把實驗做完嗎？

A2：試劑盒中染料(Dye)溶解后易氧化變質，長時間儲存會失效。建議老師多攢些樣品一次性檢測；如必須分次檢測，可以考慮單買組分。

Q3：ATP檢測試劑盒里面的檢測板可以拆分嗎？因為如果要做預實驗摸索稀釋倍數的話，可能只做幾個孔。

A3：板子不能拆分，但是可以用常規的96孔酶標板替代做預實驗。

[1] Xiong Y, Leng Y, Tian H, et al. Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA[J]. Molecular biology reports, Cell Communication and Signaling, 2023,21:192.  
[2] Xu J, Xiong A, Wang X,et al.Hyperoside attenuates pyrrolizidine alkaloids-induced liver injury by ameliorating TFEB-mediated mitochondrial dysfunction[J]. Archives of Pharmacal Research, 2023, 46(8):694-712. 
[3] CaoM J, Huang X W, Zou J L, et al. Attenuation of Microglial Activation and Pyroptosis by Inhibition of P2X7 Pathway Promotes Photoreceptor Survival in Experimental Retinal Detachment[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2023, 64(7):1-14.
[4] YeB, Pei Y T, Wang L J, et al. NAD+ supplementation prevents STING-induced senescence in CD8+ T cells by improving mitochondrial homeostasis[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2024,1-17.

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