流式輔助產品使用指南

簡述：

流式細胞術是一種基于熒光的檢測的技術，能同時測定懸浮于溶液中的單個細胞的多種特性，例如細胞群計數和蛋白豐度。流式細胞術使用熒光偶聯抗體直接檢測抗原，每種抗體對應細胞內或細胞表面的不同蛋白，可實現細胞特性的快速、定量和準確測定，并且提供針對細胞群異質性的解讀，主要優勢在于，它可以同時分析細胞群中的多個參數和多個不同的細胞標志物。

圖1 流式示意圖

樣本處理：

針對流式細胞分析進行的樣品制備是一個關鍵步驟，樣本制備的好壞對最終的檢測結果有很大的影響。常見的的樣本多為外周血、骨髓、腦脊液、胸水、腹水以及淋巴結、脾、肝等，不同類型的樣本最好在12h內進行處理，若無法及時處理，4℃保存，保存時間因樣品而異，最好不超過48h。

圖2 血液成分

以人的血液為例：

1、樣本收集后置于含抗凝劑（一般選擇肝素或EDTA）的試管中；

2、在15mL無菌離心管中加入淋巴細胞分離液(abs930) 5mL；（注意：淋巴細胞分離液使用前需恢復室溫，18-25℃）

3、Hank's液 (abs9257)或PBS緩沖液(abs962) 1:1比例（如果全血樣本粘稠，可適當增大比例）稀釋抗凝過的全血樣品；

4、小心沿著壁管，接近分離液層面，非常緩慢地加入新鮮的稀釋過的4mL全血樣品在淋巴細胞分離液上面；（注意：切記不要攪渾淋巴細胞分離液）

5、小心放進離心機（水平轉子），4℃離心20-30min，速度為400g-1000g；（注意：離心機剎車應取消，需等待自然停止）

6、取出離管，切記不要震動。可見上層為淡紅色透明血漿，其次為薄薄的只密白色環，白色環衛單核細胞淋巴細胞；

7、棄上層，吸出PBMC層，加入PBS，洗1-2次。300g，10min，離心去上清，加入抗體進行染色。

圖3 abs930人淋巴細胞分離液

腦脊液、胸水、腹水等體液：

1、樣本收集至抗凝管中，室溫或4℃保存；

2、樣本1000-1500rpm離心5min，棄去上清；

3、加入含有0.1%牛血清白蛋白的PBS，1000-1500rpm離心5min進行洗滌；

4、加入適量PBS重懸。如有細小沉淀，用40um細胞篩網（300目，藍色） abs7231過濾后備用。

淋巴結、脾、肝等組織：

組織樣品比較常用酶消化和機械破碎的方法處理成單細胞懸液。程序參照細胞培養單細胞的制備，注意可用800-1000rpm 低速離心3min去除細胞碎片的影響。

封閉(abs9476)或(abs9477)

D16是低吸附的IgG FC受體 III(FcR III)，CD32是FC受體 II(FcR II)，CD16/CD32表達于B細胞、單核細胞、NK細胞、粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞（低水平）、Kupffer細胞、未成熟胸腺細胞和某些活化的成熟T淋巴細胞。FcR表達細胞在免疫熒光染色中有時出現假陽性或假陰性結果，原因在于FcRs介導的Ig Fc結合性。

為阻斷Fc受體，100µL染色體積按照每10⁶個細胞加入0.25µg小鼠Fc受體阻斷劑，混勻，冰上孵育5-10min，之后用抗體進行染色。在此封閉和免疫染色步驟之間沒有必要進行細胞清洗。

固定(abs9110)、破膜(abs9111)

1、收貨待測細胞（流式細胞實驗，一般的細胞量就是控制在5*106-107個cell/mL； 做流式每管的細胞量可取100uL），1000rpm離心10min，棄上清；
2、加入500uL 4℃預冷的固定劑；
3、室溫避光孵育10min；
4、1000rpm離心10min；
5、棄上清，加入PBS洗一次，1000rpm離心10min；
6、棄上清，加入1.5mL破膜劑；
7、室溫孵育10-15min；
8、1000rpm離心5min；
9、棄上清，加入適量（100uL左右）破膜劑（注意加入的是破膜劑而非PBS）重懸細胞；
10、加入檢測抗體染色后，用流式細胞儀進行分析。

流式細胞常見問題

1、所有樣本在檢測之前都需要固定嗎？

我們一般在檢測胞內指標時需要固定破膜，特殊情況下，染完胞膜指標已經到很晚，可以對樣本進行固定處理，4℃放到第二天檢測，保持檢測指標的穩定性（如果染色的抗體顏色是耦聯染料（PE-Cy5、PE-Cy7、PerCp-Cy5.5）不能固定，因為耦聯染料在固定時會解偶聯，這會導致熒光染料降解。），當樣本特別多的時候，間隔會很久，這種情況下上機前也可以做一下固定，保持前后數據的一致性，此外，在蛋白翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化、甲基化等的研究過程中，固定劑可以固定住翻譯后修飾的位點，也可以防止目標位點在活細胞中很快降解。

2、細胞染色緩沖液(abs9475)和pbs相比有什么優點？

staining buffer是一種緩沖鹽水溶液，可用作抗體和細胞稀釋步驟，以及細胞表面染色和流式細胞分析的所有清洗步驟，含胎牛血清，減少抗體和熒光素對目的細胞的非特異性結合；還含疊氮鈉，是一種代謝抑制劑，能抑制細胞表面抗原的成斑和成帽現象。

成斑和成帽現象：在熒光免疫標記試驗中，兩種膜蛋白熒光抗體混合后，由于膜蛋白的流動性，一段時間后，兩種熒光蛋白抗體均勻分布在質膜上。時間繼續延長，抗體在細胞表面會重新分布，聚集在細胞的一定部位即所謂的成斑現象。經過一段時間后，二價抗體在細胞膜表面相互交聯使被標記的膜蛋白集聚在細胞的一端，即成帽現象。

3、用了Fc受體阻斷劑還需要做同型對照嗎？

同型對照抗體相當于沒有特異靶標的一抗作用是排除非特異性結合，包括：抗體與靶細胞上的 Fc受體結合；抗體與細胞蛋白、碳水化合物和脂類的非特異性結合和。但是有很多種細胞的FC受體能結合FC段（表達DC64，CD32，CD16的細胞結合力較強），同型抗體能與FC受體結合，但是結合能力和一抗是一樣的，

抗體與細胞蛋白、碳水化合物和脂類的非特異性結合，Fc受體阻斷劑解決不了，實際實驗中有些抗體較難找到同型抗體。而且，Fc受體阻斷劑相對比較便宜，是比較好的選擇。

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