多重熒光免疫組化Q&A（第一彈）

Q1：我想要進行多色實驗，對于我的樣本有什么要求嗎？
A1：您按照免疫組化的標準對您的樣本進行前處理即可。如果是從歷史切片或者蠟塊中挑選用來做多色，請盡量選取相對較新的樣本（一個月內），最長不要選保存超過半年的樣本，可能會有靶點缺失或者強非特異性，導致染色效果欠佳。

附上石蠟切片樣本處理推薦：

1）取新鮮組織（理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm），如取的組織過大，需要切小后再做固定，以免組織太厚固定液滲透不良，導致后續染色效果不佳；

2）組織離體后（不要超過30分鐘）迅速轉移到固定液中（一般選用10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛），在常溫條件下固定時間為18-24小時，不要固定太長時間，容易導致組織抗原丟失，影響陽性信號顯色；

3）浸蠟溫度應控制在58~60℃左右，浸蠟用的石蠟應經常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發脆，細胞收縮，容易導致后續染色過程中組織脫片；

4）切片厚度最佳為4微米，組織太厚容易導致染料滲透不加，且多層細胞之間熒光發生串擾，影響成像觀察。貼片需選用免疫組化專用的防脫載玻片，不要在水浴撈片環節添加任何粘合劑，撈片后豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴，不要用紙擦拭玻片；

5）切片在45℃~65℃烤箱中烤片30-60分鐘左右，到干片為止，否則后續染色過程中易脫片。但需要注意溫度過高或時間過長均會影響抗原的活性，因為在高溫干燥條件下會加速組織切片中抗原的氧化。
 

Q2：如果我的樣本是冰凍切片或者細胞爬片，可以用來做多色實驗嗎？
A2：可以的，多色實驗本身不局限您的樣本類型，但需要注意的是您的切片或者爬片能否經得起多輪抗體洗脫，在樣本不脫片的情況下，才能有一個比較好的染色效果。如果您是這類樣本，您需要額外準備一瓶抗體洗脫液（abs994），替代多色實驗中的熱修復步驟，采用溫和的洗脫方式，避免高溫高壓破壞切片。需要注意的是，您依舊需要控制切片厚度，盡量保證在單層細胞的厚度，如太厚，多層細胞之間發生重疊，熒光信號會發生串擾。（PS：石蠟切片是比較適合做多色實驗的樣本類型！）


Q3：我該如何選擇用于做多色的抗體呢？
A3：多色這項技術比較突出的一個優勢就在于對一抗種屬沒有特殊的限定，根據樣本種屬選擇即可，我們試劑盒本身配備了二抗（鼠兔通用二抗或者抗兔二抗），您在選取一抗來源的時候，盡可能選擇兔子或者小鼠來源的一抗，如確實找不到鼠或兔來源的一抗也沒有關系，您只需要再準備一個跟該一抗來源適配的能用于免疫組化的HRP二抗即可。另外，您的一抗需要能應用于IHC，并且盡量選擇單克隆抗體，多抗往往容易產生非特異性。


Q4：我注意到你們多色試劑盒中也是熒光染料，我在操作過程中需要額外避光嗎？
A4：不用的，您在常規日光燈環境下操作就可以，我們染料的熒光強度很高，不會那么容易淬滅，但涉及到需要孵育或者保存的時候還是建議您采用避光濕盒進行。


Q5：我今天做好了多色片子，但無法立即進行掃描觀察，我該怎么保存呢？
A5：染好的多色片子可以避光在4℃條件下保存較長的時間，但我們建議您完成染色以后，在兩周內完成成像，并且如果需要長時間保存，建議您用透明指甲油對蓋玻片邊緣進行密封。如保存時間過長，或保存不當，封片劑容易干掉，此時再成像會有較強非特異性，可以使用PBS把蓋玻片洗下來，重新封片以后再觀察，但成像效果依舊會打折扣，還是建議您盡快完成成像。（PS：雖然熒光染料沒有那么容易淬滅，但若多次成像反復激發，依舊會淬滅，2-3次影響不會很大，但不排除偶然性哦）


Q6：整個多色實驗一般需要多久能夠完成呀？一天能行嗎？
A6：如果您的指標比較少（2~3個指標），恰好您又是“肝帝"愿意熬夜做實驗，那么一天是可以做完的哦，因為我們多色染料有信號放大的功能，且試劑盒搭配的二抗是多聚的HRP二抗，也能放大信號，因此原本需要4℃過夜的一抗孵育，可以在室溫1小時，或者37℃烘箱一小時完成，滿打滿算一天是可以做完實驗的。但如果您不想要這么“肝"，當然可以，您只需要在一抗孵育的步驟選擇4℃過夜，第二天再來繼續做二抗孵育等后續操作就行，跟您做IHC實驗一樣，當您指標比較多的時候，可以合理安排，部分抗體室溫1小時，部分抗體4℃過夜，但也不可把“戰線"拉得太長，控制在盡可能短的時間完成實驗，畢竟遲則生變哦。

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