重磅！mRNA療法有望治療由基因突變引起的男性不育癥！

2023年2月8日，俄亥俄州立大學董一州團隊在Advanced Science發表了一篇LNP成功遞送saRNA至精母細胞治療小鼠不育的文章“Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice"。

基因突變引起的男性不育癥是不育癥的重要類型。目前，臨床上還沒有可靠的方法來解決這種醫療需求。

mRNA療法的出現為修復生殖系統中的突變基因提供了一種可能的策略。然而，將mRNA有效遞送至精母細胞仍然是一項艱巨的挑戰。因此，研究團隊希望開發一種新的LNP可以將saRNA有效遞送至精母細胞，用于治療男性不育癥。

一、CAP LNP的合成、配方和表征

為了增強mRNA遞送進入精子細胞，在生物膜和男性生殖系統起到關鍵作用的一些生物活性分子引起研究人員的關注。例如，膽固醇是哺乳動物細胞膜的重要結構成分，維持細胞膜的完整性和通透性。先前有研究報道在精子生成過程中膽固醇水平會升高，這表明膽固醇代謝與生育能力之間存在密切關系。此外，磷酸基團是磷脂的極性部分，同時也是是生物膜的關鍵組成部分，參與細胞運輸途徑。最后，氨基可以電離變為正電性的，與帶負電的mRNA相互作用。除了生物活性之外，可電離的脂質的幾何結構，可以用包封參數（P值）來描述，會極大地影響 LNPs的傳遞效率。通常，P 值大的脂質有利于形成倒錐形，有利于內體膜的倒六邊形（HII 相）轉變和遞送貨物的內體逃逸。

為了實現 LNPs 將編碼功能蛋白的 mRNA 遞送進精母細胞中，恢復精子生成的目標，他們整合了3個生物活性分子單元，設計一系列膽固醇-氨基-磷酸酯(CAP)脂質，配制成CAP LNPs。CAP LNP 由CAP、DOPE、DMG-PEG和編碼Dmc1的mRNA配制而成。在顯微注射到曲細精管后，CAP LNP將Dmc1 mRNA遞送到精母細胞，從而恢復染色體重組和精子發生。

圖1 使用CAP LNP遞送編碼Dmc1的 mRNA 的示意圖

首先，研究團隊構建了一條 CAP 衍生物的合成路線（圖 2a），并進一步表征了它們的理化性質，最終選擇了CAP2-4 LNPs進行后續研究。研究者應用 CAP2-4 LNP 在Dmc1 ^-/-小鼠模型中遞送綠色熒光蛋白(GFP) mRNA，24小時后分析 GFP 的表達。如圖 2e所示，CAP2-4 LNPs 在曲細精管周圍誘導出明顯的綠色熒光，而 MC3 LNPs 和 ALC-0315 LNPs 組中幾乎檢測不到 GFP 信號。這些結果證明 CAP2-4 LNPs 是精母細胞中 mRNA 遞送的優良載體，遞送效率明顯高于 MC3 和 ALC-0315 LNPs。

圖2 CAP 脂質的合成方法、3D結構以及在生精小管中的遞送效率比較

二、CAP LNP可將saRNA遞送至Dmc1^-/-小鼠模型中的精母細胞

接下來，作者比較了傳統 mRNA和saRNA 之間 Dmc1 蛋白的表達時程。他們將帶有 Flag 標簽的 Dmc1 mRNA 或 saRNA 封裝到CAP2-4 LNP 中，并將兩種制劑注射到 Dmc1^-/-小鼠的曲細精管中。給藥后24和72小時，通過免疫熒光染色評估曲細精管中 Dmc1 的表達。如圖3a所示，在CAP2-4 LNP-mRNA和CAP2-4 LNP-saRNA 處理的小鼠中24小時均觀察到明顯的 Dmc1 表達，但在未處理的小鼠中則沒有。CAP2-4 LNP-mRNA給藥72小時后，曲細精管中幾乎沒有熒光信號（圖3b）。相反，CAP2-4 LNP-saRNA處理組仍然顯示出強烈的熒光信號（圖3b）。這些結果表明，通過 CAP2-4 LNP 遞送 saRNA 可以維持 Dmc1 蛋白表達至少三天。

圖3 在 Dmc1^-/-小鼠中遞送編碼 Dmc1蛋白的傳統mRNA或saRNA

三、使用CAP LNP遞送saRNA恢復Dmc1蛋白功能

隨后，作者通過分析聯會復合體(SC)來檢查 Dmc1 蛋白的功能。SC 是在減數分裂 I 期間形成的特定結構，負責同源染色體的聯會。由于 Dmc1 缺陷可破壞 SC 形成并阻止減數分裂 I 后期的精子發生，因此 SC 被認為是 Dmc1 蛋白功能恢復的關鍵指標。Dmc1^-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理，處理后第4天，收集睪丸。通過 SYCP1 和 SYCP3（參與 SC 形成的兩個主要成分）的免疫熒光染色檢查精母細胞中的 SC。如圖4a所示, SYCP3和SYCP1染色清楚地顯示了 WT 小鼠的五個亞階段的特征模式，包括細線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期。在CAP2-4 LNP-saRNA 處理組中，我們觀察到處于粗線期的SC，這表明同源染色體聯會的恢復。此外，對SC在雙線期和終變期的觀察進一步證實了SC可以解體并轉運到中期（圖4b）。相反，來自 Dmc1^-/-小鼠的 SC 在前期的早期階段被阻滯，并且未觀察到粗線期、雙線期和終變期的 SC（圖4c）。如圖4d所示，在 CAP2-4 LNP-saRNA 處理后，粗線期、雙線期和終變期精母細胞的百分比分別增加到 11%、6% 和 2%?？偟膩碚f，這些結果表明使用 CAP LNP 遞送 saRNA 可恢復精母細胞中 Dmc1 蛋白的功能。

圖4 使用CAP LNP遞送saRNA可恢復Dmc1^-/-小鼠中的Dmc1功能

四、CAP LNP-saRNA 挽救 Dmc1^-/-小鼠的精子發生

最后，作者研究了通過 CAP2-4 LNP-saRNA 恢復 Dmc1 蛋白是否可以挽救 Dmc1^-/-小鼠的不育癥。Dmc1^-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理。處理后第10天，收集睪丸和附睪。睪丸和附睪切片用花生凝集素(PNA)染色，它可以特異性結合精子細胞頂體（圖5a）。PNA 染色的精子細胞位于 WT 小鼠的曲細精管和附睪管中。然而，Dmc1^-/-小鼠的睪丸和附睪中沒有細胞被 PNA-凝集素染色，表明精子細胞生產喪失。相比之下，我們在 CAP2-4 LNP-saRNA 治療組的曲細精管和附睪管中觀察到了 PNA染色的細胞，這是挽救 Dmc1^-/- 小鼠不育表型的直接證據。統計分析顯示，治療組每根小管的PNA陽性細胞數明顯高于未治療組，達到WT組的二分之一左右（圖5b）。因此，這些結果證明，使用 CAP LNP 遞送 saRNA可以有效挽救 Dmc1^-/-小鼠中的精子細胞產生。

此外，對睪丸樣本進行組織學分析以評估生精發育。如圖5c所示，WT 小鼠表現出正常的睪丸形態，而 Dmc1^-/-小鼠在精母細胞階段表現出精子發生停滯并且缺乏減數分裂后細胞。與 WT 小鼠相比，Dmc1^-/-小鼠的生發層厚度和生精管直徑顯著降低（圖5d，e）。相比之下，CAP2-4 LNP-saRNA 重建了 Dmc1^-/-小鼠的睪丸形態，增加了生發層厚度和生精管直徑（圖5d，e)。精子懸液細胞學涂片顯示，CAP2-4 LNP-saRNA處理組的附睪產生橢圓頭單尾不卷曲的精子，而未處理組未觀察到精子樣細胞（圖5f）。

圖5 使用 CAP LNP 遞送saRNA可挽救 Dmc1 ^-/-小鼠的不育表型

總的來說，這項研究利用 CAP LNPs 可以向精母細胞傳遞 mRNA，證明基于mRNA療法在治療由基因突變引起的男性生殖疾病方面的可行性。Absin擁有成熟的mRNA制備及LNP包裹技術。

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[1] Du S, Li W, Zhang Y, et al. Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice. Adv Sci (Weinh). 2023 Feb 7:e2300188.

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