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科學培養指南——類器官

更新時間：2022-11-17 點擊次數：2584

類器官簡介

類器官（Organoids）指利用成體干細胞或多能干細胞進行體外三維（3D）培養而形成的具有一定空間結構的組織類似物。盡管類器官并不是真正意義上的人體器官，但能在結構和功能上模擬真實器官，能夠模擬體內組織結構及功能并能夠長期穩定傳代培養。

類器官的種類

類器官的發展史

早在 20 世紀 80 年代，“organoid"一詞就已經提出, 1907年，美國貝克羅萊那大學教授威爾遜發現通過機械分離的海綿細胞可以重新聚集并自組織成為新的具有正常功能的海綿有機體，是未來類器官技術發展的源頭。威爾遜的研究證明了成年的有機體在無需外界幫助、無需從特定的解剖學階段開始，也具有完整的信息并可以成功發育成新的有機體。當代類器官的發展成果，主要集中在近十余年。2009年，Hans Clevers實驗室使用單個鼠LGR5+腸干細胞在體外自組織成為具有腸隱窩-絨毛結構的腸類器官，開啟了類器官發展的新篇章。

目前，多種臟器類器官已被成功構建，其中包括小腸、胃、結腸、肺、膀胱、大腦、肝臟、胰腺、腎臟、卵巢、食道、心臟等，不僅包括正常器官組織類器官，還有相應腫瘤組織類器官。近幾年涉及類器官研究的文獻數量呈直線上升趨勢，其中不乏多篇CNS等各大頂級期刊文獻。中國發表的類器官文獻數量在全球的排名從第六位（2009-2019年）躍至第二位（2020年），今次與美國。2021年，類器官被列為“十四五"國家重點研發計劃重點專項，隨著相關研究不斷深入，我國類器官技術水平將進一步提升，同時在相關企業積極布局下，類器官市場化程度將不斷提升。

類器官研究發展進程

類器官模型與其他模型比較

目前主要應用臨床藥物篩選的模型主要分為2D細胞模型，3D類器官和人源性動物移植模型（PDX）。其中腫瘤藥物篩選模型需要滿足在短時間內出具藥敏檢測結果、藥物篩查通量高、預測效果準確這三個方面，而類器官在這三方面對比其他藥篩方法都顯現出了強勁優勢。

藥篩模型對比（來源：中國網醫療頻道）

特點	2D細胞模型	類器官	PDX
生理變現	局限性模型	半生理模型	生理模型
構建時間	短	適中	較長
建模成功率	高	高	低
藥物檢測通量	很高	高	低
成本	低	適中	高
樣本量要求	少	較小活檢/手術組織	較大活檢/手術組織
血管化、免疫系統	不具備	不具備	具備
操作難以程度	容易	容易	困難
基因編輯	容易	容易	困難
腫瘤異質性	難以實現	可保留	難以實現
臨床相關性	低	高	高
生物庫建立	可操作	可操作	難以實現

類器官模型的應用

類器官培養

以小腸類器官培養為例操作方法：

實驗材料

名稱	參數	注意
基質膠		提前化凍
基礎培養基	B27 50x；N2 100x；N-Acetyl-L-cysteine1mM；Glutamax100x；HEPES 10mM ；Primocin500x；AdvancedDMEM/F12, ADMEM；細胞因子：Mouse-EGF（鼠源的表皮生長因子）50ng/ml；HumanR-spondin1 500ng/ml；Mouse-noggin（BMP的抑制劑） 100ng/ml	培養基配置時一次不要太多，建議一次配20ml，配制好后用0.22um的濾器過濾（過濾的目的是除菌），置于4℃可保存4周。
24孔細胞培養板
PBS		滅菌，預冷且加入雙抗

實驗方法

隱窩分離及接板:

（1）解剖6-8周的小鼠，取胃以下約10cm的小腸，鑷子去腸系膜，剪刀沿腸道剪開，用預冷的PBS洗3-5次，用載玻片小心的將小腸表面的絨毛刮去（顯微鏡下鏡檢），將刮好的小腸放入50ml離心管中，置于冰上；

（2）將小腸轉移至生物安全柜中，用含雙抗的PBS清洗3-5次，將小腸轉移至25ml 2mmol/L的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化30min；

（3）將消化好的小腸轉移至50 ml離心管中用含雙抗的PBS 清洗2次；

（4）加入25ml PBS適當搖晃30-50下，取部分懸液鏡檢。懸浮液用70um的過濾篩過濾到新的50ml離心管中；

（5）重復步驟4，兩次收集的濾液800rpm 離心5min；

（6）棄上清，用2ml的ADMEM重懸沉淀，取適量的懸液計數；隱窩的數量控制在5-15個/ul 最佳；

（7）取適當體積的懸液加入到1.5ml的離心管中，室溫下800rpm離心5min；

（8）棄上清，用預冷的基質膠重懸（需充分混勻）；

（9）接板，24孔板接50ul的重懸液（注：基質膠種在孔中間避免貼壁）；

（10）將接種好的板于培養箱中放置20-30min；

（11）每孔加500ul培養基，然后每隔2-3天換一次培養基，5-7天傳代一次。

注：所有的操作都要避免染菌，且組織需盡可能至于冰上。

小腸培養流程圖

類器官傳代:

（1）將傳代的隱窩冰上放置5-10min；

（2）小心吸出上清，并加入預冷的1ml 的ADMEM用大槍頭將基質膠打碎，然后調制700ul量程，吹打30下左右，此過程避免產生氣泡?？扇∵m量的懸液觀察，直至看不到大塊的隱窩為止；

（3）將懸液轉移至1.5ml離心管中，室溫800rpm離心 5min；

（4）后續接板步驟與隱窩接板步驟第8-11步一樣。

注：理論上傳一次可以擴增3-5倍，但由于操作過程中的損失，因此一般只能擴增3倍。

凍存及復蘇：

10%的DMSO，20%FBS，ADMEM補足，將懸液轉移至凍存管后，放入凍存盒中于-80℃冰箱中保存24h，若長久保存，24h后需放入液氮罐中保存。復蘇參照復蘇細胞方法。

腫瘤類器官培養方法以腸癌為例：

實驗材料

名稱	貨號
基質膠	abs9495
Organotial結直腸癌類器官培養基試劑盒	abs9445

試劑盒組成

組分	名稱	規格	保存
A組分	結直腸癌類器官緩沖液	100ml	4℃
B組分	結直腸癌類器官基礎培養基	100ml	4℃
C組分	organo原代酶解液	25ml	4℃
D組分	organo消化液	25ml	4℃
E組分	organo原代酶終止液	100ml	4℃
F組分	組織保存液	100ml	4℃
G組分	organo凍存液	25ml	4℃

實驗方法

1、原代

（1）將組織放入含有特殊組織保存液F的組織取樣瓶中放入冰盒4℃，拍照并登記信息。

（2）取樣瓶消毒，組織放入培養皿，結直腸癌類器官緩沖液A清洗三次后于培養皿中剪碎，大約1mm3的組織塊。

（3）癌組織用organo原代酶解液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過程中隨時觀察消化情況）加入三倍體積organo原代酶終止液E終止消化。

（4）使用100μm孔徑的篩網進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察，可以看到明顯的組織塊，將濾液收集后于300g富集離心3-5min后移去上清，重新重懸離心。

（5）去除上清，使用適量基質膠（abs9495）進行重懸(24孔板為例，每孔30ul）之后進行鋪板（4℃下操作）拍照追蹤定位。

（6）將鋪好的板子放入37℃培養箱中10-15min成膠，添加培養基B（恢復室溫）進行培養。

類器官培養流程（基質膠法）

2、類器官傳代培養

（1）移液器吸去培養基，添加4℃類器官緩沖液A放置一分鐘。

（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置5min。

（3）離心5min棄去液體，添加適量類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體或（添加適量消化液D作用90-120S終止，離心5min棄去混合液）。

（4）類器官收集后，添加適量類器官凍存液G，按500個/ml密度凍存（或進行步驟5）。

（5）類器官收集后，基質膠重懸，每孔30μl基質膠鋪在24孔板中，放置培養箱中10min添加500μl結直腸癌類器官培養基B。

3、類器官復蘇

（1）取10ml于15ml離心管中。

（2）從液氮罐中取出凍存的腫瘤類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。

（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2 分鐘內融解。

（4）將溶解后的類器官細胞快速轉移至15ml 無菌離心管，使用移液管輕輕吹打3次，300g 離心 3分鐘，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量結直腸癌類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。

（5）基質膠重懸，每孔20μl基質膠鋪在24控板中，放置培養箱中10min添加500μl結直腸癌類器官培養基B。

培養基培養腸癌類器官Day1-Day11的培養照

胃類器官

基礎培養基添加物	細胞因子	小分子化合物
N2	EGF	Y-27623
N21	FGF-10	Gastrin
N-Acetylcysteine	Noggin	A 83-01
B27	R-Spondin 1	Nicotinamide
Penicillin/Streptomycin	Wnt-3a	SB 202190
DMEM/F-12
GlutaminePlus

結腸類器官

基礎培養基添加物	細胞因子	小分子化合物
N2	EGF	Y-27623
N21	FGF-10	A 83-01
N-Acetylcysteine	Noggin	Nicotinamide
B27	R-Spondin 1	SB 202190
Penicillin/Streptomycin	Wnt-3a
DMEM/F-12
GlutaminePlus

腦類器官

基礎培養基添加物	細胞因子	小分子化合物
N2	BDNF	Y-27623
N21	DKK1	Dorsomorphin
N-Acetylcysteine	EGF	GDC-0068
B27	FGF-basic	MK-2206
Penicillin/Streptomycin	GDNF
DMEM/F-12	Noggin
GlutaminePlus
Insulin
2-mercaptoethanol

肺類器官

基礎培養基添加物	細胞因子	小分子化合物
N2	Activin A	CHIR 99021
N21	FGF- basic	SB 431542
N-Acetylcysteine	Noggin
B27
Penicillin/Streptomycin
DMEM/F-12
GlutaminePlus

肝類器官

基礎培養基添加物	細胞因子	小分子化合物
N2	BMP-4	A 83-01
N21	EGF	DAPT
N-Acetylcysteine	FGF-10	Forskolin
B27	HGF	Nicotinamide
Penicillin/Streptomycin	Noggin	PGE2
DMEM/F-12	R-Spondin 1	Y-27623
GlutaminePlus	Wnt-3a
	FGF- basic

胰腺類器官

基礎培養基添加物	細胞因子	小分子化合物
N2	EGF	A 83-01
N21	FGF-10	Gastrin
N-Acetylcysteine	Noggin	Nicotinamide
B27	R-Spondin 1
Penicillin/Streptomycin	Wnt-3a
DMEM/F-12
GlutaminePlus

腎臟類器官

基礎培養基添加物	細胞因子	小分子化合物
N2	Activin A	CHIR 99021
N21	BMP-2	Retinoic Acid
N-Acetylcysteine	BMP-4	Y-27623
B27	BMP-7
Penicillin/Streptomycin	FGF-9
DMEM/F-12	FGF- basic
GlutaminePlus

前列腺類器官

基礎培養基添加物	細胞因子	小分子化合物
N2	Activin A	A 83-01
N21	EGF	SB 202190
N-Acetylcysteine	FGF-10	Nicotinamide
B27	Noggin	CHIR 99021
Penicillin/Streptomycin	R-Spondin 1	PGE2
DMEM/F-12	Wnt-10b	Testosterone
GlutaminePlus	FGF- basic

小分子化合物介紹

產品名稱	介紹
A 83-01	ALK4/ ALK5/ ALK7抑制劑
Retinoic Acid	維甲酸信號通路
CHIR 99021	GSK-3β抑制劑
DAPT	Notch通路抑制劑
Dorsomorphin	BMP和AMPK通路抑制劑
Forskolin	cAMP激活劑
Gastrin	胃泌素
Nicotinamide	Sirtuin去乙酰化酶抑制劑
PGE2	前列腺素E2
SB 202190	p38 MAPK抑制劑
Y-27623	ROCK1抑制劑

小愛本期推薦

類器官培養基試劑盒

培養簡單：培養基集成多種因子，無需添加其他因子和再優化；

擴增效率高：培養的類器官能夠快速增長；

維持穩定傳代：維持至少3代以上擴增，部分類器官每次傳代可實現10代以上擴增；

性價效益比：按照GMP級別生產條件下制備，批次質量穩定，價格優勢明顯。

貨號	品名	規格
abs9446	Organotial乳腺癌類器官培養基試劑盒	1kit
abs9448	Organotial子宮內膜癌類器官培養基試劑盒	1kit
abs9445	Organotial結直腸癌類器官培養基試劑盒	1kit
abs9444	Organotial肝癌類器官培養基試劑盒	1kit
abs9443	Organotial肺癌類器官培養基試劑盒	1kit
abs9449	Organotial胃癌類器官培養基試劑盒	1kit
abs9447	Organotial胰腺癌類器官培養基試劑盒	1kit

小分子化合物

貨號	品名	規格
abs812864	Y-27632	5mg
abs814916	Gastrin I (human)	5mg
abs817694	A-83-01	5mg
abs810052	CHIR-99021 (CT99021)	5mg
abs810473	DAPT	5mg
abs810530	Dorsomorphin free base	5mg
abs810050	Forskolin	5mg
abs816969	Nicotinamide	50mg
abs810009	SB202190 (FHPI)	5mg

更多相關產品推薦

基質膠

貨號	品名	規格	周期
abs9410	即用型基質膠	100ml	現貨
abs9490	基質膠（標準型、含酚紅）	1.5ml*8	現貨
abs9491	基質膠（標準型、無酚紅）	1.5ml*8	現貨
abs9492	基質膠（高濃度、含酚紅）	1.5ml*8	現貨
abs9493	基質膠（高濃度、無酚紅）	1.5ml*8	現貨
abs9494	基質膠（低因子、含酚紅）	1.5ml*8	現貨
abs9495	基質膠（低因子、無酚紅）	1.5ml*8	現貨
abs9496	基質膠（IPS驗證無酚紅）	1.5ml*4	現貨
abs9497	基質膠（高濃度、低因子、含酚紅）	1.5ml*8	現貨
abs9498	基質膠(高濃度，無酚紅，低生長因子)	1.5ml*8	現貨

細胞因子

貨號	品名	規格
abs04176	Recombinant Human Epidermal Growth Factor/EGF	50ug
abs04695	Recombinant Human Noggin	50ug
abs04398	Recombinant Human R-Spondin-1/RSPO1 (C-6His)	50ug
abs04200	Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 2/FGF-2/FGFb (Pro143-Ser288)	50ug
abs04227	Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 4/FGF-4	50ug
abs04177	Recombinant Human Insulin-Like Growth Factor I/IGF-I/IGF1	50ug
abs04228	Recombinant Human Fibroblast growth factor 10/FGF10	50ug
abs00939	Recombinant Human BMP-4	10ug
abs04174	Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein 2/BMP-2	50ug
abs04196	Recombinant Human/Mouse Activin A/INHBA	50ug
abs04355	Recombinant Human Dickkopf-Related Protein 1/DKK1 (N-8His)	50ug

參考文獻：

[1] CORNING. Using Organoids for Disease Modeling. Nov. 11, 2019.

[2] Lee, J. et al. Nat Commun 11, 4283 (2020).

[3] SCIENCING. Types of Sea Sponges. 2019.

[4] Wilson, H. V. Development of sponges from dissociated tissue cells.

[5] Sato, T. et al. Nature 459, 262–265 (2009).

[6] Corrò C et al. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.

Absin特色產品線：
WB相關：ECL發光液、預染marker、預制膠；IHC相關：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體；定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

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