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                科學(xué)培養(yǎng)指南——類器官

                更新時間:2022-11-17      點(diǎn)擊次數(shù):2583
                類器官簡介

                類器官(Organoids)指利用成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞進(jìn)行體外三維(3D)培養(yǎng)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物。盡管類器官并不是真正意義上的人體器官,但能在結(jié)構(gòu)和功能上模擬真實(shí)器官,能夠模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及功能并能夠長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

                類器官的種類

                類器官的發(fā)展史



                早在 20 世紀(jì) 80 年代,“organoid"一詞就已經(jīng)提出, 1907年,美國貝克羅萊那大學(xué)教授威爾遜發(fā)現(xiàn)通過機(jī)械分離的海綿細(xì)胞可以重新聚集并自組織成為新的具有正常功能的海綿有機(jī)體,是未來類器官技術(shù)發(fā)展的源頭。威爾遜的研究證明了成年的有機(jī)體在無需外界幫助、無需從特定的解剖學(xué)階段開始,也具有完整的信息并可以成功發(fā)育成新的有機(jī)體。當(dāng)代類器官的發(fā)展成果,主要集中在近十余年。2009年,Hans Clevers實(shí)驗室使用單個鼠LGR5+腸干細(xì)胞在體外自組織成為具有腸隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的腸類器官,開啟了類器官發(fā)展的新篇章。

                目前,多種臟器類器官已被成功構(gòu)建,其中包括小腸、胃、結(jié)腸、肺、膀胱、大腦、肝臟、胰腺、腎臟、卵巢、食道、心臟等,不僅包括正常器官組織類器官,還有相應(yīng)腫瘤組織類器官。近幾年涉及類器官研究的文獻(xiàn)數(shù)量呈直線上升趨勢,其中不乏多篇CNS等各大頂級期刊文獻(xiàn)。中國發(fā)表的類器官文獻(xiàn)數(shù)量在全球的排名從第六位(2009-2019年)躍至第二位(2020年),今次與美國。2021年,類器官被列為“十四五"國家重點(diǎn)研發(fā)計劃重點(diǎn)專項,隨著相關(guān)研究不斷深入,我國類器官技術(shù)水平將進(jìn)一步提升,同時在相關(guān)企業(yè)積極布局下,類器官市場化程度將不斷提升。


                類器官研究發(fā)展進(jìn)程

                類器官模型與其他模型比較



                目前主要應(yīng)用臨床藥物篩選的模型主要分為2D細(xì)胞模型,3D類器官和人源性動物移植模型(PDX)。其中腫瘤藥物篩選模型需要滿足在短時間內(nèi)出具藥敏檢測結(jié)果、藥物篩查通量高、預(yù)測效果準(zhǔn)確這三個方面,而類器官在這三方面對比其他藥篩方法都顯現(xiàn)出了強(qiáng)勁優(yōu)勢。

                藥篩模型對比(來源:中國網(wǎng)醫(yī)療頻道)
                特點(diǎn)2D細(xì)胞模型類器官PDX
                生理變現(xiàn)局限性模型半生理模型生理模型
                構(gòu)建時間適中較長
                建模成功率
                藥物檢測通量很高
                成本適中
                樣本量要求較小活檢/手術(shù)組織較大活檢/手術(shù)組織
                血管化、免疫系統(tǒng)不具備不具備具備
                操作難以程度容易容易困難
                基因編輯容易容易困難
                腫瘤異質(zhì)性難以實(shí)現(xiàn)可保留難以實(shí)現(xiàn)
                臨床相關(guān)性
                生物庫建立可操作可操作難以實(shí)現(xiàn)

                類器官模型的應(yīng)用



                類器官培養(yǎng)

                以小腸類器官培養(yǎng)為例操作方法:

                實(shí)驗材料

                名稱

                參數(shù)

                注意

                基質(zhì)膠

                 

                提前化凍

                基礎(chǔ)培養(yǎng)基

                B27 50x;N2  100x;N-Acetyl-L-cysteine1mM;Glutamax100x;HEPES  10mM ;Primocin500x;AdvancedDMEM/F12, ADMEM;細(xì)胞因子:Mouse-EGF(鼠源的表皮生長因子)50ng/ml;HumanR-spondin1 500ng/ml;Mouse-noggin(BMP的抑制劑) 100ng/ml

                培養(yǎng)基配置時一次不要太多,建議一次配20ml,配制好后用0.22um的濾器過濾(過濾的目的是除菌),置于4℃可保存4周。

                24孔細(xì)胞培養(yǎng)板

                 

                 

                PBS

                 

                滅菌,預(yù)冷且加入雙抗


                實(shí)驗方法

                隱窩分離及接板:

                (1)解剖6-8周的小鼠,取胃以下約10cm的小腸,鑷子去腸系膜,剪刀沿腸道剪開,用預(yù)冷的PBS洗3-5次,用載玻片小心的將小腸表面的絨毛刮去(顯微鏡下鏡檢),將刮好的小腸放入50ml離心管中,置于冰上;
                (2)將小腸轉(zhuǎn)移至生物安全柜中,用含雙抗的PBS清洗3-5次,將小腸轉(zhuǎn)移至25ml 2mmol/L的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化30min;
                (3)將消化好的小腸轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中用含雙抗的PBS 清洗2次;
                (4)加入25ml PBS適當(dāng)搖晃30-50下,取部分懸液鏡檢。懸浮液用70um的過濾篩過濾到新的50ml離心管中;
                (5)重復(fù)步驟4,兩次收集的濾液800rpm 離心5min;
                (6)棄上清,用2ml的ADMEM重懸沉淀,取適量的懸液計數(shù);隱窩的數(shù)量控制在5-15個/ul 最佳;
                (7)取適當(dāng)體積的懸液加入到1.5ml的離心管中,室溫下800rpm離心5min;
                (8)棄上清,用預(yù)冷的基質(zhì)膠重懸(需充分混勻);
                (9)接板,24孔板接50ul的重懸液(注:基質(zhì)膠種在孔中間避免貼壁);
                (10)將接種好的板于培養(yǎng)箱中放置20-30min;
                (11)每孔加500ul培養(yǎng)基,然后每隔2-3天換一次培養(yǎng)基,5-7天傳代一次。
                注:所有的操作都要避免染菌,且組織需盡可能至于冰上。


                小腸培養(yǎng)流程圖
                類器官傳代:

                (1)將傳代的隱窩冰上放置5-10min;
                (2)小心吸出上清,并加入預(yù)冷的1ml 的ADMEM用大槍頭將基質(zhì)膠打碎,然后調(diào)制700ul量程,吹打30下左右,此過程避免產(chǎn)生氣泡。可取適量的懸液觀察,直至看不到大塊的隱窩為止;
                (3)將懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中,室溫800rpm離心 5min;
                (4)后續(xù)接板步驟與隱窩接板步驟第8-11步一樣。
                注:理論上傳一次可以擴(kuò)增3-5倍,但由于操作過程中的損失,因此一般只能擴(kuò)增3倍。

                凍存及復(fù)蘇:

                10%的DMSO,20%FBS,ADMEM補(bǔ)足,將懸液轉(zhuǎn)移至凍存管后,放入凍存盒中于-80℃冰箱中保存24h,若長久保存,24h后需放入液氮罐中保存。復(fù)蘇參照復(fù)蘇細(xì)胞方法。

                腫瘤類器官培養(yǎng)方法以腸癌為例:

                實(shí)驗材料

                名稱

                貨號

                基質(zhì)膠

                abs9495

                Organotial結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

                abs9445

                試劑盒組成


                組分

                名稱

                規(guī)格

                保存

                A組分

                結(jié)直腸癌類器官緩沖液

                100ml

                4℃

                B組分

                結(jié)直腸癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基

                100ml

                4℃

                C組分

                organo原代酶解液

                25ml

                4℃

                D組分

                organo消化液

                25ml

                4℃

                E組分

                organo原代酶終止液

                100ml

                4℃

                F組分

                組織保存液

                100ml

                4℃

                G組分

                organo凍存液

                25ml

                4℃

                實(shí)驗方法



                1、原代
                (1)將組織放入含有特殊組織保存液F的組織取樣瓶中放入冰盒4℃,拍照并登記信息。
                (2)取樣瓶消毒,組織放入培養(yǎng)皿,結(jié)直腸癌類器官緩沖液A清洗三次后于培養(yǎng)皿中剪碎,大約1mm3的組織塊。
                (3)癌組織用organo原代酶解液C消化,37℃震蕩消化10-20 min,(消化過程中隨時觀察消化情況)加入三倍體積organo原代酶終止液E終止消化。
                (4)使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾,取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察,可以看到明顯的組織塊,將濾液收集后于300g富集離心3-5min后移去上清,重新重懸離心。
                (5)去除上清,使用適量基質(zhì)膠(abs9495)進(jìn)行重懸(24孔板為例,每孔30ul)之后進(jìn)行鋪板(4℃下操作)拍照追蹤定位。
                (6)將鋪好的板子放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠,添加培養(yǎng)基B(恢復(fù)室溫)進(jìn)行培養(yǎng)。


                類器官培養(yǎng)流程(基質(zhì)膠法)
                2、類器官傳代培養(yǎng)
                (1)移液器吸去培養(yǎng)基,添加4℃類器官緩沖液A放置一分鐘。
                (2)移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠,收集在15ml離心管中,4℃靜置5min。
                (3)離心5min棄去液體,添加適量類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管,300g離心5min棄去液體或(添加適量消化液D作用90-120S終止,離心5min棄去混合液)。
                (4)類器官收集后,添加適量類器官凍存液G,按500個/ml密度凍存(或進(jìn)行步驟5)。
                (5)類器官收集后,基質(zhì)膠重懸,每孔30μl基質(zhì)膠鋪在24孔板中,放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基B。

                3、類器官復(fù)蘇
                (1)取10ml于15ml離心管中。
                (2)從液氮罐中取出凍存的腫瘤類器官細(xì)胞,快速置于 37℃水浴鍋中融解。
                (3)水浴融解過程中,需輕輕搖動冷凍管,以確保凍存液在 1-2 分鐘內(nèi)融解。
                (4)將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 無菌離心管,使用移液管輕輕吹打3次,300g 離心 3分鐘,然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量結(jié)直腸癌類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
                (5)基質(zhì)膠重懸,每孔20μl基質(zhì)膠鋪在24控板中,放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基B。


                培養(yǎng)基培養(yǎng)腸癌類器官Day1-Day11的培養(yǎng)照

                胃類器官


                基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

                細(xì)胞因子

                小分子化合物

                N2

                EGF

                Y-27623

                N21

                FGF-10

                Gastrin

                N-Acetylcysteine

                Noggin

                A 83-01

                B27

                R-Spondin 1

                Nicotinamide

                Penicillin/Streptomycin  

                Wnt-3a

                SB 202190

                DMEM/F-12



                GlutaminePlus



                結(jié)腸類器官


                基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

                細(xì)胞因子

                小分子化合物

                N2

                EGF

                Y-27623

                N21

                FGF-10

                A 83-01

                N-Acetylcysteine

                Noggin

                Nicotinamide

                B27

                R-Spondin 1

                SB 202190

                Penicillin/Streptomycin  

                Wnt-3a


                DMEM/F-12



                GlutaminePlus



                腦類器官


                基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

                細(xì)胞因子

                小分子化合物

                N2

                BDNF

                Y-27623

                N21

                DKK1

                Dorsomorphin

                N-Acetylcysteine

                EGF

                GDC-0068

                B27

                FGF-basic

                MK-2206

                Penicillin/Streptomycin  

                GDNF


                DMEM/F-12

                Noggin


                GlutaminePlus



                Insulin



                2-mercaptoethanol



                肺類器官


                基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

                細(xì)胞因子

                小分子化合物

                N2

                Activin A

                CHIR 99021

                N21

                FGF- basic

                SB 431542

                N-Acetylcysteine

                Noggin


                B27



                Penicillin/Streptomycin  



                DMEM/F-12



                GlutaminePlus



                肝類器官

                基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

                細(xì)胞因子

                小分子化合物

                N2

                BMP-4

                A 83-01

                N21

                EGF

                DAPT

                N-Acetylcysteine

                FGF-10

                Forskolin

                B27

                HGF

                Nicotinamide

                Penicillin/Streptomycin  

                Noggin

                PGE2

                DMEM/F-12

                R-Spondin 1

                Y-27623

                GlutaminePlus

                Wnt-3a



                FGF- basic



                胰腺類器官

                基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

                細(xì)胞因子

                小分子化合物

                N2

                EGF

                A 83-01

                N21

                FGF-10

                Gastrin

                N-Acetylcysteine

                Noggin

                Nicotinamide

                B27

                R-Spondin 1


                Penicillin/Streptomycin  

                Wnt-3a


                DMEM/F-12



                GlutaminePlus



                腎臟類器官


                基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

                細(xì)胞因子

                小分子化合物

                N2

                Activin A

                CHIR 99021

                N21

                BMP-2

                Retinoic Acid

                N-Acetylcysteine

                BMP-4

                Y-27623

                B27

                BMP-7


                Penicillin/Streptomycin  

                FGF-9


                DMEM/F-12

                FGF- basic


                GlutaminePlus



                前列腺類器官


                基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物

                細(xì)胞因子

                小分子化合物

                N2

                Activin A

                A 83-01

                N21

                EGF

                SB 202190

                N-Acetylcysteine

                FGF-10

                Nicotinamide

                B27

                Noggin

                CHIR 99021

                Penicillin/Streptomycin  

                R-Spondin 1

                PGE2

                DMEM/F-12

                Wnt-10b

                Testosterone

                GlutaminePlus

                FGF- basic


                小分子化合物介紹


                產(chǎn)品名稱

                介紹

                A 83-01

                ALK4/ ALK5/ ALK7抑制劑

                Retinoic Acid

                維甲酸信號通路

                CHIR 99021

                GSK-3β抑制劑

                DAPT

                Notch通路抑制劑

                Dorsomorphin

                BMP和AMPK通路抑制劑

                Forskolin

                cAMP激活劑

                Gastrin

                胃泌素

                Nicotinamide

                Sirtuin去乙酰化酶抑制劑

                PGE2

                前列腺素E2

                SB 202190

                p38 MAPK抑制劑

                Y-27623

                ROCK1抑制劑

                小愛本期推薦



                類器官培養(yǎng)基試劑盒

                培養(yǎng)簡單:培養(yǎng)基集成多種因子,無需添加其他因子和再優(yōu)化;

                擴(kuò)增效率高:培養(yǎng)的類器官能夠快速增長;

                維持穩(wěn)定傳代:維持至少3代以上擴(kuò)增,部分類器官每次傳代可實(shí)現(xiàn)10代以上擴(kuò)增;

                性價效益比:按照GMP級別生產(chǎn)條件下制備,批次質(zhì)量穩(wěn)定,價格優(yōu)勢明顯。

                貨號

                 品名

                 規(guī)格

                 abs9446

                 Organotial乳腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

                 1kit

                 abs9448

                 Organotial子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

                 1kit

                 abs9445

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                 abs9444

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                 1kit

                 abs9443

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                 1kit

                 abs9449

                 Organotial胃癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

                 1kit

                 abs9447

                 Organotial胰腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

                 1kit


                小分子化合物

                貨號

                品名

                規(guī)格

                abs812864

                Y-27632

                5mg

                abs814916

                Gastrin I (human)

                5mg

                abs817694

                A-83-01

                5mg

                abs810052

                CHIR-99021 (CT99021)

                5mg

                abs810473

                DAPT

                5mg

                abs810530

                Dorsomorphin free base

                5mg

                abs810050

                Forskolin

                5mg

                abs816969

                Nicotinamide

                50mg

                abs810009

                SB202190 (FHPI)

                5mg


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                abs9493

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                 1.5ml*8

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                 1.5ml*8

                 現(xiàn)貨


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                 規(guī)格

                 abs04176

                Recombinant Human Epidermal Growth Factor/EGF

                50ug

                 abs04695

                Recombinant Human Noggin

                50ug

                 abs04398

                Recombinant Human R-Spondin-1/RSPO1 (C-6His)

                50ug

                 abs04200

                Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 2/FGF-2/FGFb (Pro143-Ser288)

                50ug

                 abs04227

                Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 4/FGF-4

                50ug

                 abs04177

                Recombinant Human Insulin-Like Growth Factor I/IGF-I/IGF1

                50ug

                 abs04228

                Recombinant Human Fibroblast growth factor 10/FGF10

                50ug

                 abs00939

                Recombinant Human BMP-4

                10ug

                 abs04174

                Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein 2/BMP-2

                50ug

                 abs04196

                Recombinant Human/Mouse Activin A/INHBA

                50ug

                 abs04355

                Recombinant Human Dickkopf-Related Protein 1/DKK1 (N-8His)

                50ug


                參考文獻(xiàn):

                [1] CORNING. Using Organoids for Disease Modeling. Nov. 11, 2019.

                [2] Lee, J. et al. Nat Commun 11, 4283 (2020).

                [3] SCIENCING. Types of Sea Sponges. 2019.

                [4] Wilson, H. V. Development of sponges from dissociated tissue cells.

                [5] Sato, T. et al. Nature 459, 262–265 (2009).

                [6] Corrò C et al. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.


                Absin特色產(chǎn)品線:
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