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                科學培養指南——類器官

                更新時間:2022-11-17      點擊次數:2584
                類器官簡介

                類器官(Organoids)指利用成體干細胞或多能干細胞進行體外三維(3D)培養而形成的具有一定空間結構的組織類似物。盡管類器官并不是真正意義上的人體器官,但能在結構和功能上模擬真實器官,能夠模擬體內組織結構及功能并能夠長期穩定傳代培養。

                類器官的種類

                類器官的發展史



                早在 20 世紀 80 年代,“organoid"一詞就已經提出, 1907年,美國貝克羅萊那大學教授威爾遜發現通過機械分離的海綿細胞可以重新聚集并自組織成為新的具有正常功能的海綿有機體,是未來類器官技術發展的源頭。威爾遜的研究證明了成年的有機體在無需外界幫助、無需從特定的解剖學階段開始,也具有完整的信息并可以成功發育成新的有機體。當代類器官的發展成果,主要集中在近十余年。2009年,Hans Clevers實驗室使用單個鼠LGR5+腸干細胞在體外自組織成為具有腸隱窩-絨毛結構的腸類器官,開啟了類器官發展的新篇章。

                目前,多種臟器類器官已被成功構建,其中包括小腸、胃、結腸、肺、膀胱、大腦、肝臟、胰腺、腎臟、卵巢、食道、心臟等,不僅包括正常器官組織類器官,還有相應腫瘤組織類器官。近幾年涉及類器官研究的文獻數量呈直線上升趨勢,其中不乏多篇CNS等各大頂級期刊文獻。中國發表的類器官文獻數量在全球的排名從第六位(2009-2019年)躍至第二位(2020年),今次與美國。2021年,類器官被列為“十四五"國家重點研發計劃重點專項,隨著相關研究不斷深入,我國類器官技術水平將進一步提升,同時在相關企業積極布局下,類器官市場化程度將不斷提升。


                類器官研究發展進程

                類器官模型與其他模型比較



                目前主要應用臨床藥物篩選的模型主要分為2D細胞模型,3D類器官和人源性動物移植模型(PDX)。其中腫瘤藥物篩選模型需要滿足在短時間內出具藥敏檢測結果、藥物篩查通量高、預測效果準確這三個方面,而類器官在這三方面對比其他藥篩方法都顯現出了強勁優勢。

                藥篩模型對比(來源:中國網醫療頻道)
                特點2D細胞模型類器官PDX
                生理變現局限性模型半生理模型生理模型
                構建時間適中較長
                建模成功率
                藥物檢測通量很高
                成本適中
                樣本量要求較小活檢/手術組織較大活檢/手術組織
                血管化、免疫系統不具備不具備具備
                操作難以程度容易容易困難
                基因編輯容易容易困難
                腫瘤異質性難以實現可保留難以實現
                臨床相關性
                生物庫建立可操作可操作難以實現

                類器官模型的應用



                類器官培養

                以小腸類器官培養為例操作方法:

                實驗材料

                名稱

                參數

                注意

                基質膠

                 

                提前化凍

                基礎培養基

                B27 50x;N2  100x;N-Acetyl-L-cysteine1mM;Glutamax100x;HEPES  10mM ;Primocin500x;AdvancedDMEM/F12, ADMEM;細胞因子:Mouse-EGF(鼠源的表皮生長因子)50ng/ml;HumanR-spondin1 500ng/ml;Mouse-noggin(BMP的抑制劑) 100ng/ml

                培養基配置時一次不要太多,建議一次配20ml,配制好后用0.22um的濾器過濾(過濾的目的是除菌),置于4℃可保存4周。

                24孔細胞培養板

                 

                 

                PBS

                 

                滅菌,預冷且加入雙抗


                實驗方法

                隱窩分離及接板:

                (1)解剖6-8周的小鼠,取胃以下約10cm的小腸,鑷子去腸系膜,剪刀沿腸道剪開,用預冷的PBS洗3-5次,用載玻片小心的將小腸表面的絨毛刮去(顯微鏡下鏡檢),將刮好的小腸放入50ml離心管中,置于冰上;
                (2)將小腸轉移至生物安全柜中,用含雙抗的PBS清洗3-5次,將小腸轉移至25ml 2mmol/L的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化30min;
                (3)將消化好的小腸轉移至50 ml離心管中用含雙抗的PBS 清洗2次;
                (4)加入25ml PBS適當搖晃30-50下,取部分懸液鏡檢。懸浮液用70um的過濾篩過濾到新的50ml離心管中;
                (5)重復步驟4,兩次收集的濾液800rpm 離心5min;
                (6)棄上清,用2ml的ADMEM重懸沉淀,取適量的懸液計數;隱窩的數量控制在5-15個/ul 最佳;
                (7)取適當體積的懸液加入到1.5ml的離心管中,室溫下800rpm離心5min;
                (8)棄上清,用預冷的基質膠重懸(需充分混勻);
                (9)接板,24孔板接50ul的重懸液(注:基質膠種在孔中間避免貼壁);
                (10)將接種好的板于培養箱中放置20-30min;
                (11)每孔加500ul培養基,然后每隔2-3天換一次培養基,5-7天傳代一次。
                注:所有的操作都要避免染菌,且組織需盡可能至于冰上。


                小腸培養流程圖
                類器官傳代:

                (1)將傳代的隱窩冰上放置5-10min;
                (2)小心吸出上清,并加入預冷的1ml 的ADMEM用大槍頭將基質膠打碎,然后調制700ul量程,吹打30下左右,此過程避免產生氣泡??扇∵m量的懸液觀察,直至看不到大塊的隱窩為止;
                (3)將懸液轉移至1.5ml離心管中,室溫800rpm離心 5min;
                (4)后續接板步驟與隱窩接板步驟第8-11步一樣。
                注:理論上傳一次可以擴增3-5倍,但由于操作過程中的損失,因此一般只能擴增3倍。

                凍存及復蘇:

                10%的DMSO,20%FBS,ADMEM補足,將懸液轉移至凍存管后,放入凍存盒中于-80℃冰箱中保存24h,若長久保存,24h后需放入液氮罐中保存。復蘇參照復蘇細胞方法。

                腫瘤類器官培養方法以腸癌為例:

                實驗材料

                名稱

                貨號

                基質膠

                abs9495

                Organotial結直腸癌類器官培養基試劑盒

                abs9445

                試劑盒組成


                組分

                名稱

                規格

                保存

                A組分

                結直腸癌類器官緩沖液

                100ml

                4℃

                B組分

                結直腸癌類器官基礎培養基

                100ml

                4℃

                C組分

                organo原代酶解液

                25ml

                4℃

                D組分

                organo消化液

                25ml

                4℃

                E組分

                organo原代酶終止液

                100ml

                4℃

                F組分

                組織保存液

                100ml

                4℃

                G組分

                organo凍存液

                25ml

                4℃

                實驗方法



                1、原代
                (1)將組織放入含有特殊組織保存液F的組織取樣瓶中放入冰盒4℃,拍照并登記信息。
                (2)取樣瓶消毒,組織放入培養皿,結直腸癌類器官緩沖液A清洗三次后于培養皿中剪碎,大約1mm3的組織塊。
                (3)癌組織用organo原代酶解液C消化,37℃震蕩消化10-20 min,(消化過程中隨時觀察消化情況)加入三倍體積organo原代酶終止液E終止消化。
                (4)使用100μm孔徑的篩網進行過濾,取少量濾液在鏡下進行觀察,可以看到明顯的組織塊,將濾液收集后于300g富集離心3-5min后移去上清,重新重懸離心。
                (5)去除上清,使用適量基質膠(abs9495)進行重懸(24孔板為例,每孔30ul)之后進行鋪板(4℃下操作)拍照追蹤定位。
                (6)將鋪好的板子放入37℃培養箱中10-15min成膠,添加培養基B(恢復室溫)進行培養。


                類器官培養流程(基質膠法)
                2、類器官傳代培養
                (1)移液器吸去培養基,添加4℃類器官緩沖液A放置一分鐘。
                (2)移液槍輕柔吹打基質膠,收集在15ml離心管中,4℃靜置5min。
                (3)離心5min棄去液體,添加適量類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管,300g離心5min棄去液體或(添加適量消化液D作用90-120S終止,離心5min棄去混合液)。
                (4)類器官收集后,添加適量類器官凍存液G,按500個/ml密度凍存(或進行步驟5)。
                (5)類器官收集后,基質膠重懸,每孔30μl基質膠鋪在24孔板中,放置培養箱中10min添加500μl結直腸癌類器官培養基B。

                3、類器官復蘇
                (1)取10ml于15ml離心管中。
                (2)從液氮罐中取出凍存的腫瘤類器官細胞,快速置于 37℃水浴鍋中融解。
                (3)水浴融解過程中,需輕輕搖動冷凍管,以確保凍存液在 1-2 分鐘內融解。
                (4)將溶解后的類器官細胞快速轉移至15ml 無菌離心管,使用移液管輕輕吹打3次,300g 離心 3分鐘,然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量結直腸癌類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
                (5)基質膠重懸,每孔20μl基質膠鋪在24控板中,放置培養箱中10min添加500μl結直腸癌類器官培養基B。


                培養基培養腸癌類器官Day1-Day11的培養照

                胃類器官


                基礎培養基添加物

                細胞因子

                小分子化合物

                N2

                EGF

                Y-27623

                N21

                FGF-10

                Gastrin

                N-Acetylcysteine

                Noggin

                A 83-01

                B27

                R-Spondin 1

                Nicotinamide

                Penicillin/Streptomycin  

                Wnt-3a

                SB 202190

                DMEM/F-12



                GlutaminePlus



                結腸類器官


                基礎培養基添加物

                細胞因子

                小分子化合物

                N2

                EGF

                Y-27623

                N21

                FGF-10

                A 83-01

                N-Acetylcysteine

                Noggin

                Nicotinamide

                B27

                R-Spondin 1

                SB 202190

                Penicillin/Streptomycin  

                Wnt-3a


                DMEM/F-12



                GlutaminePlus



                腦類器官


                基礎培養基添加物

                細胞因子

                小分子化合物

                N2

                BDNF

                Y-27623

                N21

                DKK1

                Dorsomorphin

                N-Acetylcysteine

                EGF

                GDC-0068

                B27

                FGF-basic

                MK-2206

                Penicillin/Streptomycin  

                GDNF


                DMEM/F-12

                Noggin


                GlutaminePlus



                Insulin



                2-mercaptoethanol



                肺類器官


                基礎培養基添加物

                細胞因子

                小分子化合物

                N2

                Activin A

                CHIR 99021

                N21

                FGF- basic

                SB 431542

                N-Acetylcysteine

                Noggin


                B27



                Penicillin/Streptomycin  



                DMEM/F-12



                GlutaminePlus



                肝類器官

                基礎培養基添加物

                細胞因子

                小分子化合物

                N2

                BMP-4

                A 83-01

                N21

                EGF

                DAPT

                N-Acetylcysteine

                FGF-10

                Forskolin

                B27

                HGF

                Nicotinamide

                Penicillin/Streptomycin  

                Noggin

                PGE2

                DMEM/F-12

                R-Spondin 1

                Y-27623

                GlutaminePlus

                Wnt-3a



                FGF- basic



                胰腺類器官

                基礎培養基添加物

                細胞因子

                小分子化合物

                N2

                EGF

                A 83-01

                N21

                FGF-10

                Gastrin

                N-Acetylcysteine

                Noggin

                Nicotinamide

                B27

                R-Spondin 1


                Penicillin/Streptomycin  

                Wnt-3a


                DMEM/F-12



                GlutaminePlus



                腎臟類器官


                基礎培養基添加物

                細胞因子

                小分子化合物

                N2

                Activin A

                CHIR 99021

                N21

                BMP-2

                Retinoic Acid

                N-Acetylcysteine

                BMP-4

                Y-27623

                B27

                BMP-7


                Penicillin/Streptomycin  

                FGF-9


                DMEM/F-12

                FGF- basic


                GlutaminePlus



                前列腺類器官


                基礎培養基添加物

                細胞因子

                小分子化合物

                N2

                Activin A

                A 83-01

                N21

                EGF

                SB 202190

                N-Acetylcysteine

                FGF-10

                Nicotinamide

                B27

                Noggin

                CHIR 99021

                Penicillin/Streptomycin  

                R-Spondin 1

                PGE2

                DMEM/F-12

                Wnt-10b

                Testosterone

                GlutaminePlus

                FGF- basic


                小分子化合物介紹


                產品名稱

                介紹

                A 83-01

                ALK4/ ALK5/ ALK7抑制劑

                Retinoic Acid

                維甲酸信號通路

                CHIR 99021

                GSK-3β抑制劑

                DAPT

                Notch通路抑制劑

                Dorsomorphin

                BMP和AMPK通路抑制劑

                Forskolin

                cAMP激活劑

                Gastrin

                胃泌素

                Nicotinamide

                Sirtuin去乙酰化酶抑制劑

                PGE2

                前列腺素E2

                SB 202190

                p38 MAPK抑制劑

                Y-27623

                ROCK1抑制劑

                小愛本期推薦



                類器官培養基試劑盒

                培養簡單:培養基集成多種因子,無需添加其他因子和再優化;

                擴增效率高:培養的類器官能夠快速增長;

                維持穩定傳代:維持至少3代以上擴增,部分類器官每次傳代可實現10代以上擴增;

                性價效益比:按照GMP級別生產條件下制備,批次質量穩定,價格優勢明顯。

                貨號

                 品名

                 規格

                 abs9446

                 Organotial乳腺癌類器官培養基試劑盒

                 1kit

                 abs9448

                 Organotial子宮內膜癌類器官培養基試劑盒

                 1kit

                 abs9445

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                小分子化合物

                貨號

                品名

                規格

                abs812864

                Y-27632

                5mg

                abs814916

                Gastrin I (human)

                5mg

                abs817694

                A-83-01

                5mg

                abs810052

                CHIR-99021 (CT99021)

                5mg

                abs810473

                DAPT

                5mg

                abs810530

                Dorsomorphin free base

                5mg

                abs810050

                Forskolin

                5mg

                abs816969

                Nicotinamide

                50mg

                abs810009

                SB202190 (FHPI)

                5mg


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                 1.5ml*8

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                 1.5ml*8

                 現貨


                細胞因子

                貨號

                 品名

                 規格

                 abs04176

                Recombinant Human Epidermal Growth Factor/EGF

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                Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 2/FGF-2/FGFb (Pro143-Ser288)

                50ug

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                Recombinant Human Insulin-Like Growth Factor I/IGF-I/IGF1

                50ug

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                Recombinant Human Fibroblast growth factor 10/FGF10

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                參考文獻:

                [1] CORNING. Using Organoids for Disease Modeling. Nov. 11, 2019.

                [2] Lee, J. et al. Nat Commun 11, 4283 (2020).

                [3] SCIENCING. Types of Sea Sponges. 2019.

                [4] Wilson, H. V. Development of sponges from dissociated tissue cells.

                [5] Sato, T. et al. Nature 459, 262–265 (2009).

                [6] Corrò C et al. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.


                Absin特色產品線:
                WB相關:ECL發光液、預染marker、預制膠;IHC相關:二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體;定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

                愛必信(上海)生物科技有限公司


                愛必信(上海)生物科技有限公司
                地址:上海市浦東新區新浩路58號申江科創園18棟
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