人淋巴細胞分離液操作protocal

Lymphocyte Separation Medium（human, Ficoll-Paque ）是一種無菌的、即用型的Ficoll-泛影酸鈉，能夠簡單快速的從少量或大量的人外周血、骨髓和臍帶血中高產和高純度的提純淋巴細胞的一種即用型密度梯度介質。Ficoll-Paque PLUS內毒素水平非常低，小于0.12EU/ML，分離所得的細胞中95%左右為單個核細胞，細胞存活率大于90%，回收率為60%左右。

# 操作 Protocol #

一.試劑準備

1.樣本體積: 4 ml（總） 

2.鹽緩沖液（可用PBS或生理鹽水）

A液配制

加950ml的蒸餾水溶解，用10 N HCl調節PH至7.6，zui后定容至1L。

B液配制

1體積的鹽緩沖液：取1體積的A溶液與9體積的B容液混合，每次操作至少需要 20 ml /次

★每次實驗需新鮮配置（可4℃保存一個星期）

二．分離步驟 

1.使用前上下顛倒數次確保淋巴細胞分離液充分混合 

2. 打開瓶蓋，用移液管或注射器取淋巴細胞分離液 (4ml) 至離心管. 

3. 取稀釋后的血液樣本（4ml）加入到離心管中 (Fig 1)     V(血液：鹽緩沖液：淋巴細胞分離液)=1：1：2

注意：輕輕加入樣本形成分層，避免和淋巴細胞分離液混合

4.將離心管在18–20 °C，400g 離心 30-40 min

5. 輕輕移除上層分離液（血漿）

注：輕輕操作，避免淋巴細胞層和上層分離液混合

洗滌淋巴細胞以去除血小板操作步驟：

1. 吸取淋巴細胞層至干凈的離心管，盡量減少吸取上下分層液的量（淋巴細胞分離液層會引起粒細胞污染；血漿層會引起血小板和血漿蛋白的污染）

2. 向離心管中加入至少3體積（6ml）的鹽緩沖液

3. 使用巴斯德吸管輕輕吹打使淋巴細胞層與鹽緩沖液充分混合

4. 使離心管在18–20 °C在60–100 g 離心 10分鐘

5. 去除上層分離液

6. 再向離心管中添加6-8ml的鹽緩沖液，用巴斯德吸管輕輕吹打使淋巴細胞與其充分混合

7. 18–20 °C，60–100 g 離心 10 minutes

8. 去除上層分離液即可.

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