PM原代細胞核酸轉染試劑盒

產(chǎn)品介紹：

    PM原代細胞核酸轉染試劑盒是專門用于核酸原代細胞高效轉染的試劑盒。它具有非常好的轉染性能，可高效轉染絕大多數(shù)原代細胞，轉染效率可高達 85%以上（EGFP 質粒）。其功能強大，不僅可高效轉染較大分子的質粒 DNA，還可高效轉染 mRNA、siRNA、mimics 和各種小分子 DNA。與目前市場上常見的脂質體轉染試劑不同，它采用生物可降解材料配制，對細胞的毒性很低，轉染后 24 小時細胞幾乎無明顯死亡。使用也非常方便，先將轉染試劑與質粒 DNA 混合，再將轉染試劑-DNA 復合物直接加入培養(yǎng)細胞中，血清不影響其轉染效果，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液，操作十分簡便。 

產(chǎn)品特點：

1、強大的細胞轉染性能：可高效轉染多種原代細胞，轉染效率在原代細胞中可高達85%以上；

2、轉染功能強大，不僅可高效轉染大分子質粒DNA，還可高效轉染mRNA、siRNA、mimics和各種小分子DNA；

3、極低的細胞毒性：使用可降解生物材料，細胞毒性低，轉染細胞死亡率不到10%，大大降低了因細胞毒性對實驗結果的影響；

4、操作簡便，可用于含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的轉染，轉染前后不需要更換培養(yǎng)液。

操作步驟：

一、質粒DNA 轉染（以24 孔板轉染為例）:

A、細胞接種:

1、 轉染前一天對細胞進行轉接，每孔接種0.8-1.2×10 5 個細胞，使轉染時細胞密度為90%左右，且生長良好（非常重要）；

2、 最好在轉染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉染后孵育階段細胞密度太大、營養(yǎng)不足導致細胞死亡。

B、PM /DNA轉染復合物制備(該步完成后應立即進行轉染):

1、在1.5 ml無菌離心管中加入50 ul無血清培養(yǎng)基，再加入適量的PM轉染試劑，見附表。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

2、 在1.5 ml無菌離心管中加入50 ul無血清培養(yǎng)基，并加入適量的溶液A，輕輕混勻，再加入適量的DNA，見附表。用移液器再次輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

3、將DNA-培養(yǎng)基混合物滴加至PM-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15-20分鐘后，立即轉染。注意： PM-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒。

注意：離心管最好使用聚丙烯離心管。

C、轉染:

1、 將步驟B制備的轉染復合物滴加至培養(yǎng)基中，邊加邊輕輕晃動培養(yǎng)板以使復合物均勻分布。加完后，立即將培養(yǎng)板轉入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2.、培養(yǎng)12小時后即可觀察，最佳觀察或收獲時間為24-48小時。

3、PM在培養(yǎng)基中仍有較高的轉染效率，因此轉染前后不需要換成無血清或低血清培養(yǎng)基。

二、siRNA 轉染（以24 孔板轉染為例）:

A、 細胞接種:

1、轉染前一天對細胞進行轉接，使轉染時細胞密度為30-50%左右，且生長良好、無支原體污染（非常重要）；

2.、最好在轉染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基，以防轉染后孵育階段細胞密度太大、營養(yǎng)不足導致細胞死亡。

B、PM /siRNA轉染復合物制備 (該步完成后應立即轉染):

1、 在1.5 ml無菌離心管中加入50 ul無血清培養(yǎng)基，并添加適量的PM轉染試劑(見下表) 。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

2、在1.5 ml無菌離心管中加入50 ul無血清培養(yǎng)基，并添加適量的siRNA（見下表），用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5分鐘。

3、將siRNA-培養(yǎng)基混合物滴加至 PM-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15-20分鐘后，立即轉染。

C、轉染:

1、將步驟B制備的轉染復合物滴加至培養(yǎng)基中，邊加邊輕輕晃動培養(yǎng)板。加完后，立即將培養(yǎng)板轉入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2、37°C培養(yǎng)24-72小時，檢測基因抑制效果。如果需要，細胞培養(yǎng)4-6小時可以更換培養(yǎng)基，但不是必須。

3、 PM 在培養(yǎng)基中仍有較高的轉染效率，因此轉染前后不需要換成無血清或低血清培養(yǎng)基。

注意事項：

1、 剛開始轉染，請務必進行優(yōu)化實驗，如24孔板質粒轉染，每孔質粒用量0.8 ug， PM可選擇2.0 ul、2.5 ul、3.0 ul、3.5 ul進行優(yōu)化。24孔板siRNA轉染，PM 用量2.0 ul，siRNA用量可選10 pmol、20 pmol、30 pmol、40 pmol進行優(yōu)化。

2、進行質粒轉染，接種細胞的數(shù)量應以確保轉染時的細胞匯合度在80-90%為準，過高或過低均會影響轉染效率。進行siRNA轉染，接種細胞的數(shù)量應以確保轉染時的細胞匯合度在30-50%為準。在制備DNA或siRNA轉染復合物時，應避免體系中存在血清（推薦DMEM）。培養(yǎng)體系中盡量不要添加抗生素，抗生素會導致培養(yǎng)細胞死亡。

3、溶液A僅用于質粒轉染，RNA或siRNA轉染不需加入溶液A。

4、 請注意質粒轉染和siRNA轉染時對細胞密度和轉染試劑用量等條件的差異，不要混用同一條件。

5、 如果需要質粒穩(wěn)轉，請在轉染24-48小時后加入篩選培養(yǎng)基。

6、 本產(chǎn)品適合于質粒DNA、siRNA分別獨立轉染，如需質粒DNA、siRNA共轉，請選用核酸共轉染試劑（abs60317）。

附表 1： 質粒轉染不同培養(yǎng)體系推薦初始轉染條件

附表 2：siRNA 轉染不同培養(yǎng)體系推薦初始轉染條件

儲存/保存方法：

-20°C 避光保存，有效期一年，使用前請輕輕混勻。

試劑盒組成：

產(chǎn)品用途：

適用細胞系 ：小鼠軟骨細胞，大鼠軟骨細胞，人關節(jié)軟骨細胞，人肺靜脈內皮細胞，人臍靜脈內皮細胞，小鼠肺成纖維細胞，人肺癌上皮細胞，人乳腺癌上皮細胞，人結腸癌細胞，人氣管上皮細胞， 人肝癌細胞，人宮頸癌上皮細胞，前列腺癌上皮細胞，大鼠肺靜脈平滑肌細胞，人肺動脈平滑肌細胞，大鼠心肌細胞，人纖維肉瘤細胞，大鼠骨骼肌細胞，人橫紋肌肉瘤細胞，人膠質母細胞瘤細胞， 人黑色素瘤細胞，人神經(jīng)母細胞瘤細胞，小鼠肝癌細胞，小鼠胚胎成纖維細胞等等