RIPA裂解液（強(qiáng)）

RIPA裂解液（強(qiáng)）  溶液

一、培養(yǎng)的細(xì)胞樣品
1、充分融解RIPA裂解液，之后混勻。取適當(dāng)量的裂解液，使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF（分子量：174.2 g/mol），使其最終濃度為1mM。
2、貼壁細(xì)胞：吸除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可忽略此步）。按照六孔板的每孔細(xì)胞加入150-250ul裂解液的比例加量。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。
懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指彈散細(xì)胞。按照六孔板的每孔細(xì)胞加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管，然后再裂解。
3、充分裂解后，10,000-14,000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、WB和免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)。
【裂解液用量說明】：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200μl或250μl。
二、組織樣本
1、將組織的剪切成細(xì)小的碎片，使用勻漿儀進(jìn)行勻漿。
2、充分融解RIPA裂解液，之后混勻。取適當(dāng)量的裂解液，使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF（分子量：174.2 g/mol），使其最終濃度為1mM。
3、按照每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加量。【注意：如果裂解不充分可以適當(dāng)添加用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可適當(dāng)降低用量。】
4、充分裂解后，10,000-14,000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、WB和免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)。
5、如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過高強(qiáng)度的漩渦混勻器使樣品裂解充分，之后使用相同步驟操作。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解的足夠充分。
【注意】：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散這些透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。像檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kB、p53，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。

1、裂解樣品的所有步驟都需在冰上或 4℃進(jìn)行。
2、RIPA 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為
含有基因組 DNA 等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可
以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過
超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3、不同的細(xì)胞需要加入的裂解液的量可能會(huì)不同，需要根據(jù)具體條件進(jìn)行條件篩選；
4、若裂解液產(chǎn)生沉淀或者析出，可在 37℃水浴中孵育，振蕩使沉淀或析出物溶解，若不能
溶解，可適當(dāng)加熱助溶。
5、為了您的自身安全，使用試劑前，請(qǐng)做好防護(hù)，如穿實(shí)驗(yàn)服，帶手套等。

-20℃保存，有效期12個(gè)月