Trizol

Trizol是細(xì)胞或組織總RNA抽提試劑。本產(chǎn)品采用和Invitrogen公司的TRIzol完quan相似的原理和方法，抽提的方法和步驟wan全相同。
Trizol的顏色和TRIzol相同，加入氯仿后上層呈無(wú)色，下層呈紅色，便于吸取上層水相。
Trizol對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞或組織及細(xì)菌的總RNA抽提均適用。
Trizol抽提所得RNA無(wú)DNA和蛋白污染。一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值為1.8-2.0。
裂解細(xì)胞或和組織共勻漿時(shí)，Trizol可以保持樣品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的降解。
每一百萬(wàn)細(xì)胞用Trizol抽提可得5-15μg RNA；每毫克組織用Trizol抽提可得1-10μg RNA。產(chǎn)量因細(xì)胞和組織不同而異。
Trizol抽提所得RNA可直接用于Northern，點(diǎn)雜交，純化mRNA，體外翻譯，RNase protectionassay，cDNA克隆，以及RTPCR；也可以用于基因表達(dá)芯片分析、高通量測(cè)序等對(duì)RNA質(zhì)量要求較高的情況。

1、細(xì)胞裂解：
   組織樣本： Trizol用量：每 50-100 mg 組織加 1 ml Trizol，樣品體積不應(yīng)超過(guò) Trizol 體積的 10％。
（1）將動(dòng)物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理。
（2）將研磨好的組織粉末快速轉(zhuǎn)入裝有 1 ml Trizol 的 2 ml 離心管中，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻，置于冰上， 待所有的樣品研磨完。
（3）裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體。對(duì)于富含蛋白、脂肪或多糖物質(zhì)的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結(jié)節(jié)部位等，勻漿后仍會(huì)存留有不溶物質(zhì)，可于 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，然后吸取上清至一新的離心管中。
  細(xì)胞樣本：
（1）貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，每10cm2培養(yǎng)面積（6孔板單孔或35mm平皿）加入1ml Trizol，用加樣器吹打數(shù)次，以確保細(xì)胞完quan裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。 注：Trizol的使用量應(yīng)由培養(yǎng)皿表面 積決定，而非由細(xì)胞數(shù)目決定。Trizol量不足可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染 。
（2）懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每 5-10×106動(dòng)植物或酵母細(xì)胞，或每 1×107細(xì)菌細(xì)胞加入 1ml Trizol， 用加樣器吹打，使其完quan裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。 注：添加 Trizol 前切勿洗滌細(xì)胞 ，以免 RNA 降解。必要時(shí)可以用勻漿器來(lái)裂解某些細(xì)菌或者酵母細(xì)胞 。
2、液相分離：
（1）裂解產(chǎn)物于室溫放置5min，使核酸-蛋白復(fù)合物完quan分離。（注：此時(shí)樣品可在-80℃長(zhǎng)期保存。 ）
（2）每1ml Trizol 加入0.2ml 氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min。
（3）4℃ 12,000 x g 離心15min，樣品會(huì)分成三層：桔黃色的下層有機(jī)相，中間層和無(wú)色的上層水相。
（4）吸取含總 RNA 的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所用 Trizol 試劑的 60％。
3、RNA 回收
（1）按照每 1 ml Trizol 的最初使用量加入 0.5 ml 異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫放置 10 min。
（2） 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，棄除上清，可見(jiàn)膠狀的 RNA 沉淀。
（3）按照每 1 ml Trizol 的最初使用量加入 1 ml 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻，洗滌沉淀。
（4）4℃ 12,000 x g 離心 5 min，棄除上清。
（5）室溫倒置 5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機(jī)，以免 RNA 過(guò)干，難以溶解）。
（6）加入適量（如 25ul） DEPC-ddH2O 或 TE 緩沖液，用加樣器吹打數(shù)次溶解 RNA。
（7）通過(guò) RNA 電泳以及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，確定 RNA 的濃度、純度和完整性。
（8）所得的 RNA 應(yīng)立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

4℃避光密閉保存，保質(zhì)期12個(gè)月。

1、如果需要測(cè)量 RNA 的 A260/A280 的比值，建議使用 RNA 定量緩沖液對(duì)樣品稀釋后，進(jìn)行測(cè)量。
2、所有離心管，槍頭及相關(guān)溶液都必須無(wú) RNA 酶污染。耐高溫器物可 180℃烘烤 4 小時(shí)以去除RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考慮用 0.01%的 DEPC 水浸泡過(guò)夜，然后滅菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。加 0.01% DEPC 至重蒸水或 MiliQ 級(jí)水中，處理過(guò)夜，滅菌即成 DEPC 水。
3、使用凍存的細(xì)胞或組織抽提總 RNA 的效果通常比新鮮的細(xì)胞或組織差一些。因?yàn)樵诩?xì)胞或組織凍融過(guò)程中一些細(xì)胞或組織內(nèi)的 RNase 會(huì)被釋放出來(lái)并剪切樣品。如果不能及時(shí)抽 RNA， 推薦先加入適量 Trizol，并裂解樣品后凍存。
4、必須戴一次性手套操作，且盡量不要對(duì)著 RNA 樣品呼氣或說(shuō)話，以防 RNA 酶污染。建議戴一次性口罩操作。
5、避免接觸皮膚或吸入。為防止濺入眼睛，請(qǐng)戴防護(hù)眼鏡或使用透明保護(hù)屏。如皮膚接觸 Trizol，請(qǐng)立即用大量去垢劑和水沖洗，如仍有不適，請(qǐng)聽(tīng)取醫(yī)生意見(jiàn)。
6、為了您的自身安全，使用試劑前，請(qǐng)做好防護(hù)，如穿實(shí)驗(yàn)服，帶手套等。

總RNA提取試劑（Trizol試劑）