WB實際條帶與預期不符？可算捋順了

  1、目的蛋白以其他形式存在，最常見的情況

● 翻譯后修飾：如糖基化，常見接受糖基化的氨基酸是絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)和羥賴氨酸(Hydroxylysine)，例如CD2，根據uniprot顯示，其預測分子量應該在39kda左右，但是表觀分子量一般在45kDa左右，這是由于CD2多個位點存在糖基化修飾，實際實驗中，如果想探究分子量差異是否是由糖基化引起的，可以加入糖苷酶PNGase F切去糖基后，進行WB，而除了糖基化以外，還存在磷酸化，泛素化、甲基化、乙酰化等多種翻譯后修飾。其中，糖基化、乙酰化、甲基化通常是使表觀分子量變大，磷酸化通常不變或變大。

CD2理論分子量39kDa左右

表觀分子量45kDa左右

Uniprot中顯示CD2的糖基化

● 剪切：如Caspase-7存在多種形式：

1）Procaspase-7：Caspase-7的前體形式，分子量約為37kDa；

2）Intermediate caspase-7：中間形式的Caspase-7，分子量約為28kDa；

3）Caspase-7 p20：活化的Caspase-7的片段之一，分子量約為20kDa。

Procaspase-7是Caspase-7的未活化前體形式，具有較大的分子量。當細胞受到凋亡信號刺激時，procaspase通過自身切割或被其他caspase（如initiator caspases）切割激活，形成較小的活性亞單位這些亞單位結合在一起形成有活性的異二聚體。這種情況可以設置誘導組和非誘導組進行驗證。剪切后的表觀分子量會變小。

Caspase-7兔單克隆抗體的WB結果

泳道1: HeLa全細胞裂解物20ug

泳道2: Jurkat全細胞裂解物20ug

泳道3: HEK-293全細胞裂解物20ug

二抗：山羊抗兔IgG,(H+L),1/10000稀釋時綴合的HRP

預測分子量：34kDa

觀察分子量：28,35kDa

暴露時間：180s

● 多聚體和共價結合聚體：如果表觀分子量和預測分子量呈現倍數增長，需要考慮是否是多聚體，添加還原劑如DTT可以驗證是否為非共價結合聚體。

2、蛋白異常遷移

● 對于分子量小于20kDa的蛋白

傳統的Tris-Glycine體系在用于SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）時，對于小分子量蛋白質的分離效果不佳，主要原因在于以下幾個方面：

1）離子前峰的影響：在Tris-Glycine體系中，濃縮膠通常使用pH6.8的Tris-HCl緩沖液，而電泳緩沖液和分離膠則使用pH8.3左右的Tris-Glycine緩沖液。當電泳開始時，甘氨酸(Glycine)在濃縮膠中的解離度較低，移動速度慢，形成一個移動的離子前峰。隨著電場的作用，甘氨酸逐漸解離并加速移動，在這個過程中會產生大量的自由十二烷基硫酸根離子(DS-)，這些離子會與小分子量蛋白結合，導致它們聚集或變性，從而影響分辨率；

2）低分子量蛋白質的遷移問題：由于上述原因，小分子量蛋白質在通過濃縮膠進入分離膠的過程中可能會受到阻礙，導致條帶模糊、拖尾或分辨率降低。特別是在分離小于20kDa的蛋白質或多肽時，這種現象尤為明顯；

3）緩沖系統pH值的影響：Tris-Glycine系統的pH值較高，這可能導致小分子量蛋白質在電泳過程中的某些修飾或降解，進一步影響其分離效果。

因此推薦使用Tricine-SDS-PAGE體系對20kDa以下的小分子量蛋白質或多肽進行分離。Tricine作為電泳緩沖液成分之一，其pKa值較低(8.15)，使得它在電泳過程中不會像甘氨酸那樣產生大量的游離DS-離子，從而減少了對小分子量蛋白質的影響，并且能夠提供更高的分辨率。此外，Tricine-SDS-PAGE通常采用較低濃度的丙烯酰胺凝膠，以適應小分子量蛋白質的分離需求。

● 蛋白電荷或特殊結構如氨基酸側鏈的特殊排列方式，電泳時存在遷移過快或過慢的現象。

3、蛋白marker的問題

和非預染marker相比，預染marker雖然使用更加方便，但是由于偶聯了染料，也存在分子量偏移的現象，并且同一個marker在不同的電泳體系中，遷移速度也會有所偏差。

abs923預染蛋白Marker(10-245kDa)

4、樣本制備問題

● 膜蛋白95度加熱變性會引起聚集，導致檢測條帶表觀分子量增大；

● 樣本變性或還原不che底會影響抗原表位暴露，進而影響其遷移速率，樣本制備時一定要保證上樣緩沖液足量、在保質期內、并且要選對裂解液，看清具體成分；

● 樣本一定要新鮮，有些蛋白極易發生降解，制備時要注意。

5、排除以上問題，最重要的就是要充分了解自己的樣本是否表達目的蛋白，以及表達豐度如何，并且查詢廠家的驗證圖，了解抗體的特異性如何。

WB終于有跡可循了！！！ 

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