流式細胞術從零開始說

流式細胞術(flow cytometery)是利用流式細胞儀(flow cytometer)對快速直線流動狀態中的單列細胞或生物顆粒等進行逐個、多參數、快速的定性、定量分析或分選的技術，具有檢測速度快、測量參數多、采集數據量大、分析信息全面、分選純度高、方法靈活等特點，可用于細胞大小、細胞顆粒度、DNA及RNA含量、蛋白質含量、細胞特異抗原、細胞活性、胞內PH值、細胞周期、細胞凋亡、細胞功能分析等的檢測。

通過流式細胞術進行細胞凋亡分析

abs50001 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒

FITC Annexin V染色的流式細胞術分析。 Human PBMC用12uM喜樹堿處理4h。將細胞與FITC Annexin V在含有碘化丙啶(PI)的緩沖液中孵育，并通過流式細胞術進行分析。經過2h的處理，主要有三組細胞：活細胞（FITC Annexin V和PI陰性）和凋亡早期（FITC Annexin V陽性和PI陰性）和FITC Annexin V和PI雙陽性的細胞。

流式細胞術的基本原理

深入了解流式細胞術的基本原理，必須了解流式細胞儀，流式細胞儀的基本元件包括液路系統、光路系統以及電子系統三個部分。

液路系統：確保細胞單個排列通過，每次分析一個細胞；

光路系統：產生、收集、分離和轉換光信號，為后續的數據分析提供基礎；

電子系統：處理和保存由光學系統檢測到的信號，并將這些信號轉換為可用于分析的數字數據。

液路系統

液路系統的作用是將樣品排列成單列細胞/顆粒流，并使細胞/顆粒穩定高速的通過流式細胞儀的檢測點，主要包含流動室+鞘液+廢液+上樣器+壓力控制系統

● 上樣速度越高，樣本中心液流(sample core)越粗，激光聚焦越差，分辨率越低；

● 定性測量一般對流速要求不高，例如免疫分型；

● 定量測量嚴格要求低速，例如細胞周期檢測。

流式細胞中的光信號

1、散射光信號

散射光信號是細胞的固有參數，不需要使用熒光標簽；

● 前向散射光(forward scatter)：FSC信號的強弱與細胞的大小相關；

● 側向散射光(side scatter)：SSC信號的強弱與細胞內的顆粒多少相關；

● FSC-SSC的作用：利用細胞大小和顆粒度初步區分細胞群、去除細胞碎片、去除黏連細胞。

從細胞進入激光照射區到離開，產生一個電脈沖信號。H是脈沖高度，代表脈沖信號的峰值；W是脈沖寬度，是指細胞通過激光照射區域的時間；A是脈沖信號的面積。

實際操作中，部分細胞與細胞會粘在一起，連續通過激光照射區，被儀器認定為一次信號，對我們最終的數據分析造成干擾。當粘連體出現測量高度不變，寬度和面積變為兩倍，即出現FSC-Height不變，FSC-Area和Width增大的現象。

我們可以使用FSC-A與FSC-H來排除粘連體，正常單細胞通過流式細胞儀激光照射區時，H和A是成正比增大的，而粘連體通過時，H不變，A增大，因此，可通過細胞的FSC-A(Area)與FSC-H(Height)參數wan美排除掉粘連體，也可以通過FSC-H與FSC-W來操作，但此種方法對于復雜樣本（樣本中各種細胞大小差異較大）不太適用，實際上，去除粘連體的重要步驟在樣本制備階段。

2、熒光信號

在流式細胞術中，熒光信號的產生是由于特定的熒光素分子吸收一定波長的光后躍遷到激發態，然后釋放光子（熒光）回到基態。了解熒光信號的產生以及各部分元件，有助于我們多色配色。

激光：提供單色光束，用于激發細胞中的熒光標記物，常見激光器有355nm（紫外）、405nm（紫色）、488nm（藍色）、561nm（黃綠色）、633nm（紅色）。有的流式細胞儀只配備488nm；有的流式細胞儀配備兩種激光器如488nm與638nm。多色流式則可能需要更多的激光器。

濾光片：通常包括帶通濾光片、長通濾光片、短通濾光片，帶通濾光片。帶通濾光片允許一個固定范圍內波長的光通過。如BP530/30表示允許波長515nm-545nm范圍的光通過，長通允許特定波長以上的光通過，特定波長以下的光不能通過。短通濾光片使特定波長以下的光通過。

分光棱鏡：將激光器發出的光線和細胞散射或熒光發射出來的光線分開，確保不同顏色的熒光可以被不同的檢測器準確地捕捉到。

熒光信號檢測器：檢測分光棱鏡分離出的熒光信號。每個檢測器對應一個特定的熒光波長，用于測量細胞中特定熒光標記物的強度。

電子系統

主要負責處理和數字化由光學系統檢測到的光信號

放大：當細胞或顆粒通過檢測點時，激光束照射到它們上產生的光信號（包括前向角散射(FSC)、側向散射(SSC)和熒光信號）被光電倍增管(PMT)或光電二極管(PD)探測到，并轉化為電信號。這些初始的電信號通常很弱，需要通過信號放大器進行放大。

模數轉換(ADC)：放大后的電信號通過模數轉換器(ADC)轉化為數字信號。ADC的位數（如14到24位）決定了信號的解析率和能轉化的數值范圍。

脈沖分箱(Pulse Processing)：每個細胞的所有參數的電壓脈沖會被進行分箱，即按照一定的采樣率和ADC的解析率，將模擬信號轉換為數字信號，并存儲為數據以備后續分析。

數據存儲與分析：數字信號被傳送到電腦，存儲為數據文件，以備分析。這些數據文件通常以標準的流式細胞儀文件格式輸出，如FSC數字數據文件。

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