多色熒光免疫組化和多色流式傻傻分不清？

在生物醫學研究領域，多色熒光免疫組化(mIHC)和多色流式(FCM)是兩種重要的技術，它們在檢測和分析生物樣本方面發揮著關鍵作用。盡管它們都涉及到熒光標記和多色分析，但它們的原理、樣本選擇、應用和優勢卻有著明顯的區別。本文將為您詳細解析這兩種技術的不同之處。

原理與特點

多色熒光免疫組化技術(mIHC)，也稱為酪氨酸信號放大(TSA)技術，是一種基于酪胺信號放大的多重順次免疫染色技術。這項技術利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記，允許同時檢測單個細胞或組織樣本上的多個目標靶點。mIHC技術的優勢在于其原位展示和定量分析的雙重能力，能夠全面研究細胞組成、功能和細胞間相互作用。

多色流式技術，即流式細胞術(FCM)，是一項集激光技術、光電測量技術、計算機技術、流體力學以及細胞免疫熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技細胞分析技術。FCM通過激光光源激發細胞上所標記的熒光物質的強度和顏色以及散射光的強度，對粒子進行多參數分析，包括粒子形狀和大小、細胞周期、細胞內細胞因子、細菌表面抗原、細胞DNA內含物等。

樣本要求

多色熒光免疫組化技術(mIHC)樣本要求：

1、樣本類型：mIHC通常使用福爾馬林固定的蠟塊或玻片，包括大塊組織或組織芯片(TMA)。

2、組織固定：組織應使用10%中性福爾馬林/多聚甲醛固定，正常固定時間為18-24h。

3、切片厚度：切片厚度約為4微米，使用防脫玻片。

4、樣本保存：盡量選擇相對較新的樣本（一個月內），最長不要超過半年，以免靶點缺失或強非特異性導致染色效果不佳。

5、組織處理：取新鮮組織后迅速轉移到固定液中，固定后浸蠟溫度應控制在58~60℃左右。

6、玻片要求：組織需要緊貼玻片，避免褶皺，玻片不能有破損、劃傷或污漬。

多色流式(FCM)樣本要求：

1、樣本類型：FCM需要單細胞懸液。外周血或懸浮生長的細胞可以直接制備成單細胞懸液，而貼壁細胞、實體組織或腫瘤組織需要先制備成單細胞懸液。

2、細胞活性：FCM檢測的樣本需要是活細胞，尤其是經過長時間運輸和儲存的樣本，死細胞對許多抗體有非特異性染色，因此細胞活性檢測非常重要。

3、樣本保存：理想狀態下，樣本應在采集后立刻進行處理和染色。不同類型的抗凝劑對應的保存時間不同，例如肝素抗凝的血和骨髓可保存至48-72h/室溫。

4、紅細胞去除：在進行FCM分析前，可能需要去除紅細胞，常用的方法包括紅細胞裂解法和密度梯度離心法。

5、細胞與抗體比例：需要根據不同樣本調整細胞與抗體的比例，以得到最適的細胞/抗體比例。

應用和優勢

mIHC技術在腫瘤微環境、腫瘤免疫浸潤、細胞衰老/凋亡/鐵死亡/細胞自噬等領域有著廣泛的應用。它能夠通過定量病理分析獲得組織細胞原位各種靶標類別、組分、表達量等信息，以及各靶標及其相互作用的空間定位、定性和定量等信息。

1、腫瘤微環境研究：mIHC技術可以同時獲取組織的腫瘤標記物、細胞狀態、免疫細胞分型、免疫調控、間質細胞等信息，對腫瘤免疫特征的全貌進行分析。例如，在腫瘤免疫浸潤和趨化因子受體表達研究中，mIHC技術能夠展示不同細胞之間的原位相互作用，這對于理解腫瘤微環境及藥效評估尤為重要。

2、腫瘤免疫治療藥效評估：mIHC在評估抗PD-1/PD-L1治療反應中顯示出更高的準確性。相比于單指標IHC、TMB和GEP等評估方式，mIHC方法預測抗PD-1/PD-L1治療的反應更準確，提供了更高的曲線下面積(AUC)。

3、減少組織樣本損耗：mIHC技術可以在單個切片中標記多個標志物，減少樣本損耗，特別適用于臨床珍貴樣本或穿刺等小組織量樣本。

FCM技術在細胞生物學、分子生物學、免疫學、血液學、腫瘤學、遺傳學等多個領域有著廣泛的應用。它能夠進行細胞大小、細胞顆粒度、DNA及RNA含量、蛋白質含量、細胞特異抗原、細胞活性、胞內PH值、細胞周期、細胞凋亡、細胞功能分析等的檢測。

多色流式(FCM)的應用：

1、腫瘤細胞參數檢測：FCM可以檢測腫瘤細胞的增殖活性標志分子、分化/凋亡標志分子等，用于研究腫瘤的發病機制、制定個性化治療方案以及進行預后判斷。例如，通過FCM檢測細胞DNA含量，可以作為細胞發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變的重要標志。

2、微小殘留病變(MRD)監測：FCM在惡性血液病MRD監測中具有高敏感性和特異性，已成為臨床療效觀察和預后分層的重要依據。

3、腫瘤免疫狀態評估：FCM通過TBNK分析精準評估腫瘤患者的免疫狀態，有助于早期診斷惡性腫瘤，進而為患者后續的治療提供指導和依據。

總結

總的來說，mIHC和FCM在生物醫學研究中扮演著不同的角色。mIHC技術側重于組織層面的多靶點分析，強調原位展示和定量分析，適用于研究細胞組成、功能和相互作用。而FCM技術則側重于單個細胞的多參數分析，適用于細胞生物學和免疫學等領域的研究。了解這兩種技術的區別，可以幫助科研人員根據研究需求選擇合適的技術平臺。

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