TR-FRET熱門應用介紹——藥物研發如虎添翼

TR-FRET（Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer，時間分辨熒光共振能量轉移）是一種用于研究分子間相互作用的生物物理技術。它結合了兩種技術：熒光共振能量轉移(FRET)和時間分辨熒光（TRF，Time-Resolved Fluorescence）。熒光共振能量轉移是一種物理現象，其中一個熒光分子（供體）在吸收光能后，可以將激發能量非放射性地傳遞給另一個分子（受體），如果受體在空間上足夠接近供體（通常在1-10nm范圍內）。這種能量轉移的效率與供體和受體之間的距離的六次方成反比，因此可以用來研究分子間的接近程度和相互作用。時間分辨熒光(TRF)是一種測量熒光壽命的技術，它通過在停止激發光源后測量熒光衰減來區分短壽命的背景熒光和長壽命的信號熒光。這允許在激發后的一個特定時間窗口內測量熒光，從而減少背景干擾，提高信號的信噪比。利用這項技術可以高效篩選靶向蛋白/蛋白受體抑制劑、篩選靶向蛋白降解的PROTAC分子、篩選KRAS/cRAF小分子阻斷劑等。

熒光共振能量轉移原理圖

時間分辨熒光原理圖

細胞因子/細胞因子受體阻斷劑篩選

細胞因子抑制劑類藥物在醫學界的應用和研究領域顯示出廣泛的潛力，特別是在治療自身免疫性疾病、腫瘤、感染和其他多種疾病方面。

在自身免疫性疾病治療方向， IL-2和IFN是治療自身免疫性疾病的重要細胞因子抑制劑。IL-2已被廣泛研究用于治療多種自身免疫性疾病，盡管其開發受到挑戰，但仍然是治療這些疾病的關鍵藥物之一。IFN-α主要用于治療病毒性感染和腫瘤，其對慢性活動性肝炎和毛細胞白血病的療效較為顯著。最近，針對B淋巴細胞刺激因子(BLyS)的抑制劑（如貝利尤單抗）已在中國獲得上市批準，另有20多種藥物正在積極開發中，用于治療類風濕關節炎等其他自身免疫性疾病。IL-1受體拮抗劑在治療炎癥和自身免疫性疾病方面顯示出較好的療效。

在腫瘤治療方向，抑制腫瘤細胞中的特定細胞因子信號通路是當前腫瘤治療的策略之一。例如，抗TNF單克隆抗體在腫瘤治療中的應用，以及利用PD-L1/IL-15 Immunocytokines治療腫瘤的新型療法正在發展中。小分子蛋白質-蛋白質相互作用抑制劑，這類藥物能夠抑制細胞內的信號傳導，用于癌癥治療，特別是通過抑制關鍵的信號分子如STAT3來阻斷腫瘤信號通路。另外，CDK4/6抑制劑在乳腺癌治療中顯示出潛力，已有三種藥物獲批用于治療激素受體陽性乳腺癌患者。

感染和炎癥性疾病治療方向，抑制炎癥反應的細胞因子產生和受體結合是治療感染性休克和自身免疫性疾病的有效方法。

細胞因子抑制劑類藥物在多個疾病的治療中顯示出顯著療效，但也面臨著副作用大、耐藥等挑戰。隨著新技術和新藥物的開發，未來可能會有更多選擇和更好的療效。

圖1 TR-FRET技術用于篩選細胞因子阻斷劑原理模型一

如圖所示，Tag1與Tag2之間的相互作用是通過使用Eu標記的抗Tag1抗體（TR-FRET供體）和Accepter標記的抗Tag2抗體（TR-FRET受體）檢測的。由于Tag1與Tag2結合介導供體抗體與受體抗體接近，供體抗體的激發會觸發向受體抗體的熒光共振能量轉移(FRET)，使受體抗體特異性發射665nm波長的信號。該特定信號與Tag1與Tag2相互作用的程度成正比。該均相實驗操作簡單，無需洗滌步驟。

圖2 TR-FRET技術用于篩選細胞因子阻斷劑原理模型二

如圖所示，Tag1與Tag2之間的相互作用是通過使用Eu標記的抗Tag1抗體（TR-FRET供體）和Accepter標記的Tag2蛋白（TR-FRET受體）檢測的。由于Tag1與Tag2結合介導供體抗體與受體抗體接近，供體抗體的激發會觸發向受體抗體的熒光共振能量轉移(FRET)，使受體抗體特異性發射665nm波長的信號。該特定信號與Tag1與Tag2相互作用的程度成正比。該均相實驗操作簡單，無需洗滌步驟。

相關產品推薦

數據展示：以下數據不能代替實驗中獲得的數據，只作為示例，結果可能因TR-FRET兼容儀器而異。

1、TNF-a & TNFR1 Binding

2、TNF-a & TNFR2

3、IL-2 & IL-2R

4、IL-3 & IL-3R

5、IL-4 & IL-4R

6、IL-17 & IL-17RA

靶向蛋白降解的PROTAC分子篩選體系

PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras）是一種利用細胞內的泛素-蛋白酶體系統來選擇性降解靶蛋白的新興藥物設計策略。近年來，隨著對PROTAC技術的不斷發展，它的應用已遠遠超越了最初針對癌癥治療的范圍，拓展到了包括免疫疾病、神經退行性疾病、心血管疾病、感染性疾病等多個領域。

在癌癥治療方向，PROTAC技術在癌癥治療方面取得了顯著進展。例如，ARV-110作為靶向雄激素受體(AR)的口服小分子PROTAC，已進入了治療轉移性去勢抵抗性前列腺癌的I期臨床試驗。針對非小細胞肺癌的研究中，出現了具有高效力的PROTAC分子，并在體內外及體內實驗中顯示出良好的療效。另外，針對EGFR的PROTAC分子也在非小細胞肺癌的治療中顯示出優勢。傳統的靶向療法常常因靶蛋白的突變或過表達而導致耐藥，PROTAC技術通過降解而不是簡單抑制靶蛋白，顯示出克服這些耐藥機制的潛力。例如，針對癌癥治療中常見的耐藥問題，PROTAC提供了一種新的治療選擇。

PROTAC技術不僅限于癌癥治療，還在其他多種疾病中顯示出應用前景，如心血管疾病、神經疾病、代謝性疾病等。例如，利用PROTAC技術開發的ER靶向口服藥物ARV-471，在治療ER陽性、HER2陰性乳腺癌的臨床試驗中展現出潛力。該技術允許針對那些傳統認為“不可成藥"的靶點進行藥物開發，為藥物發現提供了新的途徑。例如，針對激酶抑制劑的非特異性和耐藥問題，PROTAC提供了一種新的解決方案。

PROTAC技術引起了學術界和工業界的廣泛關注，顯示出在藥物開發方面的巨大潛力。但仍面臨諸多挑戰，如如何提高其細胞內外的穩定性和細胞滲透性，以及如何克服由此引起的潛在副作用。總結來說，PROTAC技術通過其特殊的作用機制，為多種疾病的治療提供了新的可能，尤其是在克服傳統藥物的局限性方面展現出優勢。

圖3 TR-FRET技術用于篩選PROTAC分子技術原理模型

如所示，Tag1與Tag2之間的相互作用是通過使用Eu標記的抗Tag1抗體（TR-FRET供體）和Accepter標記的抗Tag2抗體（TR-FRET受體）檢測的。由于分子膠PROTAC介導了Tag1與Tag2 的相互作用，供體抗體與受體抗體接近，供體抗體的激發會觸發向受體抗體的熒光共振能量轉移(FRET)，使受體抗體特異性發射665nm波長的信號。該特定信號與PROTAC和Tag1/Tag2的相互作用的程度成正比。該均相實驗操作簡單，無需洗滌步驟。

相關產品推薦

數據展示：以下數據不能代替實驗中獲得的數據，只作為示例，結果可能因TR-FRET兼容儀器而異。

1、DDB1/CRBN & BDR4，Protac : BET Degrader-1

2、DDB1/CRBN & GSPT1，Protac : CC-885

KRAS/cRAF小分子阻斷劑篩選體系

KRAS蛋白是一種GTP酶，其功能是將GTP水解為GDP，這是細胞內信號傳導過程中的一個重要步驟。KRAS蛋白是RAS家族的一員，是腫瘤發生中最常見的突變基因之一，約占人類腫瘤的20-25%。它在多種癌癥類型中都有突變，包括肺癌、結直腸癌和胰腺癌。KRAS蛋白的突變通常會導致其持續激活，從而引發多種癌癥信號傳導途徑，促進癌細胞的增殖、存活和轉移。

KRAS蛋白的突變有不同的亞型，包括G12C、G12D和G12V等，其中G12C突變是最常見的。針對KRAS G12C突變的小分子抑制劑已經進入臨床試驗，并且在非小細胞肺癌和結直腸癌患者中顯示出潛在的治療效果。

MRTX1133是由Mirati Therapeutics開發的一種小分子抑制劑，它針對的是KRAS G12D突變體，這是最常見的KRAS突變形式，在多種實體瘤中具有廣泛的存在，尤其是在胰腺導管腺癌(PDAC)中，約93%的病例存在KRAS突變，其中G12D和G12V是很普遍的。MRTX1133是shou個非共價、強效且選擇性的KRAS G12D抑制劑，具有較好的臨床表現。

該實驗使用Europium-labeled anti-6xHis和Acceptor-labeled GST檢測不同突變的Kras蛋白和cRAF(RAF1)蛋白間的相互作用，MRTX1133從300nM進行2倍梯度稀釋，孵育1h后檢測信號。 數據顯示出較好的S/B窗口（~7倍），較高靈敏度及一定選擇性（G12D IC50最小）。

圖4 TR-FRET技術用于篩選KRAS/cRAF小分子阻斷劑技術原理模型

如圖所示，KRAS WT/GTP/cRAF的相互作用是通過使用Eu標記的抗Tag1抗體（TR-FRET供體）和accepter標記的抗Tag2抗體（TR-FRET受體）檢測的。由于KRAS WT/GTP/cRAF相互作用，供體抗體與受體抗體接近，供體抗體的激發會觸發向受體抗體的熒光共振能量轉移(FRET)，使受體抗體特異性發射665nm波長的信號。該特定信號與KRAS WT/GTP/cRAF的相互作用的程度成正比。該均相實驗操作簡單，無需洗滌步驟。

已上線產品試劑盒

數據展示：以下數據不能代替實驗中獲得的數據，只作為示例，結果可能因TR-FRET兼容儀器而異。

1、KRAS WT & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

2、KRAS G12C & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

3、KRAS G12D & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

4、KRAS G12V & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

5、KRAS G12R & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

6、KRAS G13C & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

7、KRAS G13D & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

8、KRAS Q61H & cRAF Binding, Inhibitor : MRTX1133

參考文獻：

[1] Small Molecule Protein–Protein Interaction Inhibitors as CNS Therapeutic Agents: Current Progress and Future Hurdles.Richard R Neubig; Levi L Blazer

[2] Effects of 17-DMAG on non-small cell lung cancer cell lines A549 and H1975 being resistant to EGFR-TKI.Zhao, Lei; Cao, Fumin

[3] Latest Overview of the Cyclin-Dependent Kinases 4/6 Inhibitors in Breast Cancer: The Past, the Present and the Future.Zhang, Wei; Chen, Xiu; Xu, Weilin ; et al.

[4] Proteolysis targeting chimera (PROTAC) in drug discovery paradigm: Recent progress and future challenges,Zeng, Shenxin; Huang, Wenhai; Liyan Cheng; et al.

[5] Overcoming Cancer Drug Resistance Utilizing PROTAC Technology.Zheng, Guangrong; Burke, Matthew R; Smith, Alexis R

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