類器官污染鑒別與除菌攻略（一）

一、概述

類器官污染是一個老生常談的事情，尤其是做胃腸道，組織本身帶來的菌群數量非常龐大，一旦消毒不到位，就會導致類器官培養失敗。類器官污染常見類型有細菌、真菌、支原體、黑膠蟲等污染源，今天小愛帶大家學習鑒別類器官污染及除菌方案。

二、類器官污染鑒別

1、細菌污染

細菌污染-肉眼下

污染特征：

● 肉眼下可明顯觀察基質內有明顯黑色球體物；

● 而且呈多個黑色球狀物分布；

● 生長迅速，通常D1就有會出現；

● 培養液隔夜即會變紅黃渾濁。

細菌污染-鏡下類器官原代提取D1

細菌污染特征：

● 細菌集落呈黑色團球狀，wan全不透；

● 外圍模糊，有朦朧感；

● 爆發非常快，一般1-2天即可出現大量集落。

細菌克星

2、真菌污染

左圖 真菌污染特征——霉菌

右圖 真菌污染特征——根霉

霉菌污染特征：

● 早期并不會使得培養基變黃變渾濁，但在顯微鏡下可觀察到菌絲體；

● 真菌形成的菌絲呈絲狀，管狀，樹枝狀，串珠狀。

真菌污染——酵母菌

小鼠胃類器官P0D1中發現的酵母菌團從左到右依次是4X、10X、20X

類器官基質膠中的酵母菌污染

類器官基質膠中的酵母菌+根霉污染

酵母菌污染特征：

● 酵母菌呈類似棉花絮狀的團狀物；

● 酵母菌等，當其行出芽生殖時可從一大一小的連體結構識別；

● 細胞被污染后，仍可生長，長時間類器官活力狀態會變差；

● 梅雨季時的污染率會提高。

真菌克星

3、黑膠蟲

黑膠蟲污染特征：

● 活躍扭動；

● 多呈桿狀；

● 培養基不渾濁。

黑膠蟲清除劑PLUS (500×) abs9841

產品優勢：

1）性能穩定：通過細菌、真菌、支原體、內毒素檢測；通過滲透壓、pH檢測；通過產品性能檢測；

2）高效快速：有效實現對“黑膠蟲"的抑制和滅殺，減少不必要的實驗損失；

3）環保安全：經上百種細胞驗證無毒害作用。

使用方法：

1）請在收到貨后， 將試劑管瞬時離心(3000rpm，3~5s)保存；

2）使用黑膠蟲清除劑處理時， 建議現配現用， 并保持細胞密度在50%~60%；

3）推薦稀釋比例為1:500。例如5mL培養基中加入10μL的黑膠蟲清除劑。丟棄舊的培養基， 用PBS將細胞清洗干凈， 再加入含有黑膠蟲清除劑的新鮮培養基， 2天一次，連續處理一周。

黑膠蟲預防劑（1000×）abs9842

產品優勢：

1）高效穩定：通過產品性能檢測，能夠有效防治細胞培養中的“黑膠蟲"污染問題；

2）環保安全：對細胞無毒性作用，在細胞培養過程中不會對細胞造成影響，本產品為多肽類，不像抗生素會影響細胞生長狀態并讓細胞產生耐藥性。

使用方法：

1）使用黑膠蟲預防劑(1000X)時， 建議現配現用；

2）推薦黑膠蟲預防劑(1000X)的稀釋比例為1:1000, 例如：10mL的培養基加入10μL的黑膠蟲預防劑(1000X)。

4、支原體污染

支原體是實驗室中常見的污染細胞的原核生物，污染主要來自組織、血清等動物性原材料和操作者本身。支原體直徑在0.1-0.3μm，顯微鏡下也很難分辨，一般通過吸取培養液上清采用qPCR技術擴增DNA檢測。

1）檢測原理

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，其5’末端攜帶熒光基團（報告基團），如FAM、CY5、VIC等，3’端攜帶淬滅基團，如TAMRA、BHQ1等。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一條特異性的熒光探針，探針完整時，熒光基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收。PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而熒光監測系統（熒光定量PCR儀）可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成wan全同步。本試劑盒采用多重PCR的方法，用2種不同的熒光探針分別檢測目標序列與內參。

2）清除試劑

支原體清除試劑Plus abs9253

產品優勢：

● 特異性清除培養基中的支原體；

● 只需要3-6天，便可以有效清除支原體；

● 活性成分為抗生素，不會產生耐藥性；

● 對細胞幾乎無毒性，在100多種細胞上進行過驗證，包括但不限于HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等；

● 廣譜性，可替代雙抗，可以清除常見的革蘭氏陰性和陽性菌；

● 可直接加入血清、培養基中，用于清除支原體污染。

3）使用方法

A、儲存液的配制： 

稱取適量支原體清除試劑，配制成10mg/mL的儲存液。適當分裝后-20℃保存。如長時間不使用，也可以-80℃保存；

B、預防支原體污染或抑制支原體：

在細胞培養液中加入適量支原體清除試劑儲存液，使最終濃度為0.01-0.5μg/mL，通常推薦使用的濃度為0.2μg/mL或0.5μg/mL。在添加了前述劑量的支原體清除試劑的情況下，可以有效防止支原體污染或抑制支原體增殖；

C、清除污染的支原體：

對于發現或懷疑有支原體污染的細胞，在細胞培養液中加入適量支原體清除試劑儲存液，使最終濃度為0.5-250μg/mL。推薦依次嘗試使用25、50、100和250μg/mL這4個濃度。在添加了前述劑量的支原體去除試劑的細胞培養液中培養1周后，檢測是否還存在支原體污染。如果還是存在支原體污染，可以酌情提高支原體清除試劑的工作濃度。

5、非污染情況

因為類器官原代培養中，會有很多雜質、組織碎片、成纖維細胞等，容易造成細胞“污染"的假象，其實并非污染，如下所示：

1）成纖維細胞

成纖維細胞的胞體細長，又呈纖維樣，很容易被誤認為是菌絲體，被誤判成真菌污染。其實仔細觀察，成纖維細胞成梭形，胞體中間粗，兩頭細長，而菌絲體整體粗細均勻。

左圖 基質膠底層貼壁生長的成纖維細胞

右圖 真菌污染特征——霉菌

2）組織碎片

在提取原代細胞的過程中，在組織解離過程中產生很多細胞碎片及雜質，故原代培養背景會比較臟，這種情況也容易被誤認為污染。接下來，小愛帶大家了解一下組織碎片特點：

● 原代組織碎片往往成不規則形狀，區別于菌團橢圓形菌落形態；

● 原代組織雜質往往大小不一，形態各異；菌團形態均一，均為橢圓狀。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎一起交流哦！

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