WB內參選擇指南

1、什么是內參？

內參是Western Blot實驗中用于標準化和校正實驗誤差的一類蛋白質。它們通常是在不同組織和細胞中表達相對恒定的蛋白質，由管家基因編碼，常用作檢測目的蛋白表達水平變化時的參照物。

2、內參在WB中的作用是什么？

校正實驗誤差：內參用于校正蛋白質定量和上樣過程中的實驗誤差，以保證實驗結果的準確性。由于不同的樣品在蛋白質提取、定量、上樣等步驟中可能存在操作誤差，使用內參可以對這些誤差進行校正。

半定量分析：通過比較內參和目標蛋白的信號強度，可以對實驗結果進行半定量分析。如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉膜實驗時，分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量，然后將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得到內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，用此數值進行樣品間的比較和分析。

作為空白對照：內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否wan全，以及整個Western Blot顯色或者發光體系是否正常。

確保實驗結果的可比性：在比較不同條件下或不同組織中目的蛋白表達量的相對多少時，內參提供了一個參照標準，確保了實驗結果的可比性。

3、常見的WB內參有哪些？

β-Actin：β-肌動蛋白是一種細胞骨架蛋白，分子量42KDa左右，廣泛分布于各種組織中，表達量豐富且相對恒定。它通常用作總蛋白的內參，尤其是在非肌肉組織中。然而，需要注意的是，β-Actin在某些特定組織（如心肌）中的表達量可能較低，因此并非在所有情況下都適用。此外，不同的β-Actin亞型在不同組織中的分布也有所不同，選擇抗體時需考慮這一點。

大鼠腦裂解物20μg 

人結腸癌組織

Hela細胞 

abs171598 Rabbit anti-β-Actin Monoclonal Antibody

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）：36kD左右，GAPDH是一種廣泛表達的蛋白，適用于多種細胞類型。然而，在某些條件下，如缺氧或糖尿病，GAPDH的表達可能會受到影響，因此需要根據實驗條件謹慎選擇。

1: HeLa whole cell lysate 20ug Lane

2: THP-1 whole cell lysate 20ug Lane

 3: MCF7 whole cell lysate 20ug Lane

4: NIH/3T3 whole cell lysate 20ug Lane

5: mouse spleen lysate 20ug Lane

 6: C6 whole cell lysate 20ug Lane

7: rat spleen lysate 20ug 

abs132004 Rabbit anti-GAPDH Polyclonal Antibody

β-Tubulin：55kDa左右，β-Tubulin是微管蛋白的一種，參與構成細胞骨架。由于其在細胞中的穩定表達，尤其用于檢測細胞骨架蛋白時。β-Tubulin的表達在多種細胞類型中相對恒定，但同樣需要考慮特定條件下的表達變化，如在凋亡細胞中。

Hela細胞全裂解物

大鼠腎組織

NIH3T3細胞

abs171597 Rabbit anti-β-Tubulin Monoclonal Antibody

除了以上介紹的內參以外，還有α-Tubulin、Hsp90等等，每個內參的分子量及適用情況不一樣，建議選擇之前做好功課。

4、如何挑選合適的內參，需要考慮哪些因素？

目的蛋白分子量：內參蛋白的分子量應與目標蛋白的分子量相差至少5kDa以上，以確保在凝膠電泳和Western Blot中能夠清晰地區分目標蛋白和內參的條帶。

樣本種屬來源：不同種屬的樣本可能需要選擇不同的內參蛋白。例如，哺乳動物的組織或細胞樣本常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH等，而植物樣本可能選擇plant actin、Rubisco等作為內參。

細胞定位：根據目標蛋白的亞細胞定位選擇相應的內參。例如，如果是檢測全細胞或細胞質蛋白，可以選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH等；如果是核蛋白，則可能選擇Lamin B、Histone H3等作為內參。

實驗環境：內參的選擇還需要考慮實際的實驗環境和樣品的前處理。在某些特殊條件下，一些內參蛋白的表達可能會發生變化，從而影響其作為內參的穩定性和可靠性。例如，在缺氧或糖尿病等條件下，GAPDH的表達可能會增加，因此可能不適合作為內參。

組織特異性：不同的組織可能需要選擇不同的內參。例如，肌肉組織中可能需要選擇特定的肌動蛋白亞型作為內參，而在非肌肉組織中則可能選擇β-actin等。

5、內參抗體和目標抗體如何孵育？

順序孵育：在檢測完目標蛋白后，使用strip緩沖液洗掉膜上的抗體，然后重新進行內參蛋白的抗體溫育和顯色檢測。這種方法需要在兩次孵育過程中使用同一張膜。

雙膜法：在蛋白轉膜后，根據預染的蛋白質Marker的大小將膜剪成大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行孵育和顯色。

同時孵育（如果分子量相差較大）：如果目的蛋白的分子量與內參蛋白的分子量相差較大，可以在轉膜后的同一張膜上同時進行兩種抗體的孵育。由于條帶位置的差異，可以在同一張膜上分別檢測內參和目標蛋白。

使用標記內參抗體：有些實驗室使用預先標記有酶（如HRP）的內參抗體，這樣可以在二抗孵育時加入這種標記內參抗體，按照正常操作進行顯色。

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