免疫衛士-T細胞培養攻略

T細胞作為免疫系統的衛士，肩負著適應性免疫的重擔，在細胞免疫和體液免疫都有著關鍵性的作用。不僅如此，基于T細胞的三大免疫療法：CAR-T、TCRT、TILs也在“遍地開花"。截止目前，FDA共批準了6款CAR-T產品，中國也上市了5款CAR-T產品，全球共有11款CAR-T產品獲批！2024年2月16日，TIL療法- lifileucel（LN-144）獲批上市，用于治療晚期黑色素瘤，成為有望攻克實體瘤的又一把利劍。

類器官與T細胞的共培養也是一大研究“爆點"：T細胞與腫瘤類器官共培養，可為優化個性化實體瘤靶向細胞療法提供支持[1]，也可基于類器官免疫共培養技術的藥物篩選平臺，篩選出能改善腫瘤免疫原性的表觀遺傳調節藥物[2]。

不可否認的是，這些巨大成就都依賴于T細胞的體外培養，那么T細胞的體外擴增培養又是如何實現的呢？小愛接下來會從T細胞來源---培養---激活---擴增---分化---活力維持---功能檢測---熱門研究八個方面給大家介紹。

1、T細胞來源

可來源于捐獻者的血液或者其他實體組織樣本，進而通過樣本制備、細胞分選等操作獲得高純度高活性的T細胞。具體樣本制備和細胞分選的內容，小伙伴們可以參考之前的文章：《免疫細胞培養通關技巧之樣本制備》和《免疫細胞培養通關技巧之細胞分選》。用于癌癥治療的原代T細胞通常來自自體（患者）或同種異體（非患者）供體。自體樣本是CAR-T療法等過繼細胞治療的標準做法，有助于避免在輸回患者體內時與非自身抗原發生自身免疫反應。在這些情況下，培養和擴增工程化T細胞至關重要，因為癌癥患者的天然T細胞數量通常會減少。

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2、T細胞培養

培養體系

可使用經典的培養體系，即基礎培養基（實驗室中培養T細胞較常用的培養基是RPMI-1640）+胎牛血清或者無血清培養基。需要注意的是，胎牛血清作為動物源制品，若培養的T細胞后續用于人類治療時則需慎重，小愛更傾向于推薦大家使用無血清的培養體系。

圖1含血清和無血清培養體系的區別

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培養條件

T細胞的培養溫度為37°C；CO2 濃度通常為5%；此外，也需要防止細菌、真菌、支原體、內毒素、病毒等污染物的出現。這部分的內容大家可以參考《免疫細胞培養通關技巧之質量優化》。

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3、T細胞激活

自然狀態下，T細胞的激活需要兩個信號：第一個信號T細胞上的抗原特異性T細胞受體（TCR/CD3）與抗原提呈細胞（APC）上的抗原肽-MHC分子復合物的相互作用，即抗原識別過程，第一信號是T細胞活化所必須的，但不能引起T細胞增殖和細胞因子釋放。當T細胞表面表達的共刺激分子與APC表達的配體相結合時，就生成了第二個T細胞激活信號，其中最重要的是T細胞表面CD28分子與APC表面相應配體B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的結合。而在體外培養T細胞時，則借助CD3和CD28抗體來模擬兩個激活信號。另外，也可以將CD3和CD28抗體偶聯磁珠或多聚體以激活T細胞，或者使用商品化的激活擴增試劑盒。

圖2 T細胞的體內體外激活示意圖

抗體法[3]：在體外聯合使用抗CD3和CD28的抗體刺激T細胞，抗CD3單克隆抗體識別 TCR-CD3復合體上CD3分子的ε鏈并相互作用，從而增強T淋巴細胞的活化與增殖。抗CD28單克隆抗體與B7-CD28復合體上的CD28分子相互作用，能提供有效的共刺激信號，激發T細胞增殖，可誘導T細胞的分化、增殖和IL-2等細胞因子的分泌。從而模擬T細胞活化的雙信號作用。

a)  使用anti-human CD3抗體（無菌PBS稀釋）包被24孔板，包被濃度1μg/mL；室溫放置4h（也可4℃包被過夜），吸去未結合的抗體懸液；

b)  每孔加入500μL含1%BSA的PBS溶液進行封閉，室溫30min，結束后用無菌PBS洗滌1次；

c)  PBMC接種于上述24孔板中，接種密度1*106/mL，培養體系為含10%熱滅活胎牛血清、1%雙抗、3μg/mL anti-human CD28、100IU/mL human IL-2的RPMI-1640培養基；

d)  培養3天后，收集細胞，計數，臺盼藍染色檢測細胞活力，用于進一步分析。

注意事項：

a)  原代T細胞一般在體外的培養時間不超過三周，用于功能實驗的T細胞建議培養時間在14天以內。

b)  抗體法中CD3和CD28的包被濃度需要摸索確定，一般為1-10ug/ml，且多采用CD3包被，CD28游離的方法。

c)  磁珠法中，磁珠分為微米級和納米級，納米級是通過換液，或者離心清洗就可以去除，微米級則通過MACSiMAG分選器去除磁珠和抗體。

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4、T細胞擴增

T細胞擴增使研究人員能夠生成大量T細胞，以最大限度地發揮治療潛力。通常會在培養物中添加特定細胞因子，例如白細胞介素2 (IL-2) 或 IL-7/IL-15，以支持T細胞擴增和存活。21年一篇文獻發現：T細胞密度為2.5×105cell/mL時的擴增效果優于較高或較低密度，且在高于50IU/mL的IL-2濃度下表現出更高的擴增效率[4]。當需要大量抗原特異性T細胞時，可以反復接觸抗原以激活T細胞從而達到擴增的目的，但是反復激活的方法應謹慎使用，因為它會導致T細胞衰竭和功能下降。在擴增階段，可以觀察T細胞克隆團的形成、檢測細胞增殖情況或者流式細胞術檢測相應的細胞標記物。

圖4 T細胞擴增階段形成的克隆團[5]

5、細胞分化

不同類型的效應T細胞在免疫調節網絡中發揮著核心作用，該網絡充當人體的防線，并在疾病狀態下引發免疫反應。如Th1細胞因子在識別和清除細胞內病原體如病毒和細菌，包括結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌和利什曼原蟲方面起著重要作用；Th2細胞介導針對細胞外寄生蟲、細菌、過敏原和毒素免疫反應的活化和維持；Th17細胞在宿主防御細胞外病原體中發揮作用；Treg對維持自身耐受性和免疫細胞穩態至關重要。T細胞體外誘導分化需要添加的細胞因子或抗體大家可以參考圖5，同時小愛也給大家匯總了一份體外誘導T細胞分化方案（圖6）。

圖5 Na?ve T細胞在不同抗體或細胞因子作用下誘導分化為對應亞型

圖6 體外誘導T細胞分化方案[6]

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6、T細胞活力維持

T細胞活力對于任何T細胞培養實驗或治療的成功都至關重要，在這里需要確認三個方面的因素：避免T細胞培養密度過高而出現密度抑制的現象；確保培養體系可以提供T細胞必需的營養物質和生長因子；保證培養環境的無菌。

7、T細胞功能檢測

一旦培養出足夠數量的T細胞，就可以通過各種實驗方法來評估T細胞的表型、功能和活力，比如：

1）細胞毒性試驗：測量T細胞殺死靶細胞（例如癌細胞或感染細胞）的能力。

2）ELISpot檢測：酶聯免疫吸附斑點（ELISpot)實驗可量化特定細胞因子的分泌，從而了解T細胞的功能。

3）流式細胞術：可用于分析T細胞的表面標志物、胞內蛋白及信號轉導。

圖7 T細胞不同亞型的表面標記物、轉錄因子以及分泌的細胞因子

8、T細胞熱門研究

小愛以發表在Nature Protocols的《Tumor organoid–T-cell coculture systems》中描述的腫瘤類器官與T細胞共培養為例給大家介紹：

1）類器官part：在開始共培養之前，需從腫瘤組織中獲取腫瘤細胞建立腫瘤類器官，在共培養前兩天從基質膠中分離腫瘤類器官，共培養前一天用IFN-γ進行刺激，共培養當天，將腫瘤類器官解離成單細胞。

2）T細胞part：從外周血中分離PBMC，具體的操作方法也可以參考《免疫細胞培養通關技巧之樣本制備》。

3）共培養part： 將腫瘤類器官單細胞懸液與PBMC一起培養在涂有anti-CD28的培養皿中，并加入IL2和anti-PD1。共培養一周后，將新的腫瘤類器官解離成單細胞懸液再次刺激PBMC。共培養兩周后，可凍存T細胞（黃色）、評估T細胞對腫瘤細胞的反應性（綠色）或進行腫瘤類器官殺傷實驗（藍色）。

圖8 腫瘤類器官- T細胞共培養系統流程圖[7]

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注意事項：

1）共培養前使用IFN-γ刺激腫瘤類器官的目的是使后續共培養時抗原呈遞MAX；

2）共培養時加入anti-PD1是為了抵消IFN-γ對PD-L1的誘導；

3）腫瘤類器官與免疫細胞共培養時，需要精確控制免疫細胞比例及激活狀態；

4）免疫系統對腫瘤的反應是動態變化的，包括免疫監視、免疫逃逸和腫瘤免疫編輯等過程，這些都需要在模型中得到有效模擬。

參考文獻：

[1] Dekkers, J.F., et al., Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nature Biotechnology, 2022. 41(1): p. 60-69.

[2] Zhou, Z., et al., A T Cell‐Engaging Tumor Organoid Platform for Pancreatic Cancer Immunotherapy. Advanced Science, 2023. 10(23).

[3] Soltantoye, T., et al., Soluble and Immobilized Anti-CD3/28 Distinctively Expand and Differentiate Primary Human T Cells: An Implication for Adoptive T Cell Therapy. Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology, 2022.

[4] Ghaffari, S., et al., Optimizing interleukin-2 concentration, seeding density and bead-to-cell ratio of T-cell expansion for adoptive immunotherapy. BMC Immunology, 2021. 22(1).

[5] Zhang, D.K.Y., A.S. Cheung, and D.J. Mooney, Activation and expansion of human T cells using artificial antigen-presenting cell scaffolds. Nature Protocols, 2020. 15(3): p. 773-798.

[6] Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.

[7] Cattaneo, C.M., et al., Tumor organoid–T-cell coculture systems. Nature Protocols, 2019. 15(1): p. 15-39.

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