染色質免疫沉淀法(ChIP)手冊（一）

1、什么是CHIP、CHIP研究什么？

CHIP全稱染色質免疫沉淀法，是一種用于研究蛋白質與DNA相互作用的實驗技術。它可以用來檢測特定的蛋白質-DNA相互作用，如組蛋白、轉錄因子等與基因組特定區域的結合情況。ChIP技術可以幫助研究者了解細胞或組織中的基因表達和調控機制。

圖1 組蛋白八聚體

* 名詞解釋

組蛋白：真核生物細胞核中的一種堿性蛋白質，它們的主要功能是幫助DNA分子的壓縮和組織，使其能夠適應細胞核內有限的空間。組蛋白與DNA一起構成了染色體的基本結構單元，稱為核小體。

轉錄因子：是一類蛋白質，它們可以結合到DNA分子上的特定序列，從而調控基因的轉錄過程。轉錄因子在細胞中扮演著至關重要的角色，它們控制著基因表達的時間、地點和程度，從而影響細胞的功能和生物體的發育。

轉錄輔因子：是一類在增強子與啟動子之間傳遞調控信息的蛋白質，它們是轉錄激活和基因表達的核心效應分子。轉錄輔因子通過與特定的轉錄因子相互作用，增強或抑制基因的轉錄。它們可以對不同類型的核心啟動子表現出特異性，這意味著不同的轉錄輔因子可能對不同的啟動子類型有偏好性，從而影響基因表達的特異性和多樣性。

2、ChIP能做什么，使用場景有哪些？

確定特定蛋白質在基因組中的結合位點：通過使用針對特定蛋白質的抗體，可以將這些蛋白質及其結合的DNA片段從細胞中沉淀下來，然后通過測序或PCR分析這些DNA片段，從而確定蛋白質的DNA結合位點。

研究蛋白質-DNA相互作用的動態變化：可以在不同的時間點或不同的生理條件下進行ChIP實驗，以研究蛋白質與DNA相互作用的變化，例如在細胞分化、發育或響應環境信號時。

分析組蛋白修飾：ChIP實驗可以用來研究特定組蛋白修飾在基因組中的分布，這些修飾與基因的激活或沉默有關。

研究轉錄因子的DNA結合特性：通過ChIP實驗，可以確定轉錄因子在基因啟動子區域或增強子區域的結合情況，從而揭示其調控基因表達的機制。

全基因組分析：結合下一代測序技術(ChIP-seq)，ChIP實驗可以用于全基因組范圍內的蛋白質-DNA相互作用分析，提供高分辨率的基因組結合圖譜。

使用場景舉例：

如果您對一種特定的轉錄因子如何在不同發育階段調控基因表達感興趣。你可以在胚胎發育的不同階段進行ChIP實驗，使用針對該轉錄因子的抗體來沉淀與其結合的DNA片段。通過測序這些DNA片段，你可以確定該轉錄因子在基因組中的結合位點，并分析這些位點在不同發育階段的變化。這些數據可以幫助你理解該轉錄因子如何調控特定基因的表達，從而影響胚胎的發育過程。

另一個例子是研究組蛋白修飾。如果你想了解在細胞應激反應中，組蛋白H3的乙酰化修飾是如何變化的，你可以在應激前后進行ChIP實驗，使用針對乙酰化H3的抗體。通過比較應激前后的ChIP結果，你可以揭示應激如何影響組蛋白修飾模式，進而調控基因表達和細胞功能。

3、ChIP有哪些類型？

根據是否使用交聯劑，可以分為天然ChIP(N-ChIP)和交聯ChIP(X-ChIP)。

標準ChIP(X-ChIP)：在這種實驗中，使用交聯劑（如甲醛）來固定細胞，這樣可以將蛋白質與DNA之間的相互作用固定下來。交聯是必要的步驟，因為它可以穩定蛋白質與DNA之間的暫時性或弱相互作用，使得在后續的染色質制備和免疫沉淀過程中這些相互作用不會解離。適用于研究那些與DNA結合不是非常穩定的蛋白質，如轉錄因子。

天然ChIP(N-ChIP)：在這種實驗中，不使用交聯劑。這種方法通常用于研究那些與DNA結合非常穩定的蛋白質，如某些組蛋白修飾，它們的結合足夠穩定，以至于不需要額外的交聯就能在實驗過程中保持與DNA的結合。

4、ChIP 實驗中磁珠法和瓊脂糖珠法有什么不同？

操作便利性：使用磁珠可以快速分離蛋白質-DNA復合物，不需要離心，操作簡便，樣品不容易丟失，洗得更che底。傳統的方法是使用瓊脂糖珠，價格便宜，但需要離心，耗時長，且在離心過程中珠子可能破裂。

特異性：磁珠法通常具有較高的特異性，因為磁珠表面可以更均勻地結合抗體，減少了非特異性結合。瓊脂糖珠法需要額外的預清除步驟來減少這種非特異性結合。

成本：磁珠法雖然操作簡便，但磁珠的成本通常高于瓊脂糖珠。瓊脂糖珠法成本較低，適合預算有限的實驗室。

應用范圍：磁珠法適用于高通量測序，如ChIP-Seq，因為磁珠不會在測序過程中產生干擾。

瓊脂糖珠法：適用于傳統的ChIP實驗，但在高通量測序中可能會受到限制。

*為什么瓊脂糖珠法會影響測序？

瓊脂糖珠與DNA的結合：在ChIP實驗中，目標是沉淀與特定蛋白質（如組蛋白修飾或轉錄因子）結合的DNA。瓊脂糖珠表面通常通過共價鍵結合有蛋白質A或蛋白質G，這些蛋白質能夠與抗體的Fc段結合。當抗體與蛋白質結合后，與之相連的DNA也應該被捕獲。然而，瓊脂糖珠本身也可能非特異性地結合DNA，這種結合可能會在珠子表面形成一層DNA包裹，從而阻礙DNA的洗脫和后續的分析。

物理屏障：被瓊脂糖珠非特異性結合的DNA可能形成一種物理屏障，阻止洗脫緩沖液中的化學成分接觸到所有被捕獲的DNA，或者阻礙測序平臺的酶和試劑接觸到目標DNA。這種物理屏障會影響DNA的洗脫效率和測序的覆蓋度。

洗脫效率：在ChIP實驗的最后階段，需要將沉淀的DNA從瓊脂糖珠上洗脫下來以便進行后續的分析，如PCR、qPCR或測序。如果DNA被封閉，洗脫效率會降低，導致洗脫下來的DNA量減少，這會影響后續實驗的靈敏度和準確性。

測序覆蓋度：由于DNA封閉現象，一些DNA片段可能無法被有效地洗脫和擴增，導致測序時這些區域的覆蓋度不足。這可能會導致對DNA-蛋白質相互作用的分析產生偏差，因為某些區域可能被錯誤地認為是沒有相互作用發生的。

測序準確性：DNA封閉還可能導致測序數據的準確性下降。由于封閉的DNA片段可能無法被測序平臺準確讀取，這可能會導致數據中的假陰性結果。

5、ChIP是如何工作的？

圖2 chip實驗流程

以交聯ChIP即X-ChIP為例，實驗的工作原理可以概括為以下幾個步驟：

交聯：細胞或組織首先被甲醛或其他交聯劑處理，這一步使得蛋白質與DNA之間的相互作用以及蛋白質之間的相互作用被固定下來，防止在后續步驟中解離。

細胞裂解和染色質剪切：交聯后的細胞被裂解，釋放出染色質。

染色質隨后被剪切成較小的片段，這可以通過超聲波處理(sonication)或酶消化（如使用微球菌核酸酶MNase）來實現。這一步是為了讓目標DNA片段變短，便于后續的沉淀和分析。

免疫沉淀：使用針對特定蛋白質的抗體進行免疫沉淀。這些蛋白質可以是直接與DNA結合的轉錄因子，也可以是與DNA相互作用的組蛋白或其修飾形式。

抗體與目標蛋白質結合后，通過與蛋白質A或蛋白質G偶聯的珠子(beads)來沉淀這些復合物。

逆轉交聯：沉淀下來的蛋白質-DNA復合物被加熱或其他方法處理以逆轉交聯，使蛋白質與DNA分離。

DNA純化和分析：釋放的DNA被純化，并通過PCR、qPCR、微陣列或測序（如ChIP-seq）等方法進行分析，以確定特定蛋白質在基因組中的結合位點或組蛋白修飾的分布。

數據分析：對于ChIP-seq等高通量測序數據，需要通過生物信息學工具進行分析，以識別富集的DNA區域，并通過比較不同樣本或條件下的數據來揭示蛋白質-DNA相互作用的差異。 

6、ChIP如何實現細胞交聯

在ChIP實驗中，細胞交聯通常是通過使用甲醛或多聚甲醛來實現的。交聯的目的是將蛋白質與DNA之間的相互作用固定下來，以便在后續的實驗步驟中進行分析。

甲醛：能夠穿透細胞并與蛋白質的氨基酸殘基以及DNA的堿基發生反應，形成穩定的共價鍵。甲醛交聯的特點是形成的共價鍵是可逆的，這意味著在后續實驗中可以通過特定的化學處理（如加入甘氨酸）來終止交聯，以便進行DNA和蛋白質的分離和分析。

多聚甲醛：多聚甲醛是甲醛的聚合形式，通常以粉末狀態存在，使用前需要在熱水中溶解以形成甲醛溶液。多聚甲醛在水溶液中會緩慢釋放甲醛，因此也可以用于細胞的交聯。

多聚甲醛的優點是它比甲醛更穩定，便于儲存和處理，但釋放甲醛的速度較慢，在使用時需要確保wan全水解成甲醛。

7、過度交聯的影響

蛋白質結構破壞：過度交聯可能會改變蛋白質的三維結構，導致蛋白質變性，從而影響其與DNA的相互作用。

抗原表位掩蓋：交聯劑可能會與蛋白質的抗原表位發生反應，從而掩蓋這些表位，使得后續的抗體無法有效識別和結合目標蛋白質。

DNA損傷：過度交聯可能導致DNA鏈之間過度交聯，使得DNA片段在超聲或酶消化過程中難以被有效切割，影響染色質片段化的質量。

分辨率降低：在ChIP實驗中，理想的DNA片段大小通常在200-800 bp之間。過度交聯可能會使得超聲處理難以將染色質切割到理想的片段大小，從而降低實驗的分辨率。

實驗重復性差：由于過度交聯的條件難以精確控制，每次實驗的交聯程度可能存在差異，這會導致實驗結果的重復性變差。

樣品損失：在過度交聯的情況下，蛋白質和DNA的復合物可能在后續的洗滌和純化步驟中損失，因為過度交聯可能增強這些復合物之間的結合力。

圖3 交聯時間的影響

小鼠心臟(H)、腦(B)和肝臟(L)細胞需交聯10min或30min，如圖（左小圖）所示。染色質制備后聲處理4min，富集的DNA通過使用指ding基因引物進行實時PCR來進行定量（右小圖）。每份樣品中的免疫沉淀DNA量表示為標準化信號與陰性位點GAPDH的比值（等于1）。

*圖片來源于網絡，僅供學習參考用

8、為什么要將染色質片段化？

提高抗體接觸：染色質是DNA和組蛋白緊密結合的復合物，通常存在于細胞核中。在ChIP實驗中，需要使用特定抗體來識別并結合目標蛋白質。將染色質片段化可以增加抗體接觸和結合目標蛋白質的機會。

便于免疫沉淀：染色質片段化后，DNA片段的長度通常在200-1000堿基對之間。這樣的片段大小便于抗體識別和結合，同時也便于后續的免疫沉淀步驟。

提高分辨率：通過將染色質切割成較小的片段，ChIP實驗可以提供更高的分辨率，從而更精確地定位蛋白質在基因組上的結合位點。

減少背景信號：適當的染色質片段化有助于減少非特異性的背景信號，因為較大的染色質片段可能包含多個非目標結合位點，導致非特異性的免疫沉淀。

便于DNA純化和分析：較小的DNA片段更容易從蛋白質中分離出來，便于后續的DNA純化和分析，如PCR、測序或微陣列分析。

提高實驗效率：適當的染色質片段化可以提高ChIP實驗的效率，因為較小的片段更容易被處理和分析，從而減少了實驗操作的復雜性和時間。

9、超聲法和酶解法的區別？

超聲法：能夠產生隨機大小的DNA片段，適用于需要評估組蛋白和組蛋白修飾的實驗，因為這些是染色質的富集和穩定組分。超聲法適合于X-ChIP，即交聯后的染色質。但是需要優化超聲處理條件以避免過度破碎。超聲處理產生熱量，需要在冰冷的條件下進行，并且要避免氣泡的產生（氣泡會導致局部溫度無法有效冷卻，影響效率和準確性，同時會造成剪切力不均等）。在實驗的一致性和重復性對比酶解法較差。

酶解法：使用微球菌核酸酶(MNase)等酶進行染色質的溫和碎裂，相對溫和更適合于評估轉錄因子和輔因子的結合，因為這些因子與DNA的相互作用可能不太穩定。酶解法在實驗之間具有更高的可重復性，并且產生的DNA片段大小相對一致，但酶消化可能不會產生染色質的隨機切片，而是有偏好性地切割某些區域，可能導致某些位點被過度表達或遺漏。此外，酶解法操作仍需要超聲處理來打破核膜并在用酶消化后釋放出染色質。

X-ChIP常用的染色質片段化的方式為酶解法（微球菌核酸酶MNase）和超聲法，N-ChIP更依賴于酶解法。

10、如何確定染色質片段化的程度？

瓊脂糖凝膠電泳是較常用的方法來檢查染色質片段化的效果，che底的MNase消化會產生含150個堿基對的DNA片段（單核小體），不che底的消化也能產生含150-750個堿基對的DNA片段（單核小體、雙核小體和三核小體）。超聲處理產生150-1000個堿基對的許多染色質片段。要確定獲得所需DNA大小并避免不必要的染色質損傷所需要的最di聲處理量。

圖4 酶消化的染色質在瓊脂糖凝膠上進行處理

泳道1顯示消化不足的染色質。泳道2顯示消化適當的染色質，而泳道3則顯示過度消化的染色質。

*圖片來源于網絡，僅供學習參考用

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