外泌體研究解決方案

背景介紹

外泌體(exosomes)是一類由細(xì)胞分泌到胞外的囊泡，最早由Pan和Johnstone在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)包括血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、癌細(xì)胞、干細(xì)胞等在內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞都可以產(chǎn)生外泌體，所產(chǎn)生的外泌體不僅存在于細(xì)胞培養(yǎng)液中，也存在于血液、尿液、母乳、唾液、胸腔積液等體液中。外泌體可攜帶供體細(xì)胞中的一些物質(zhì)，被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊和物質(zhì)交換的重要載體，可通過(guò)直接或間接的形式調(diào)控細(xì)胞的功能和生物學(xué)行為。研究表明，外泌體參與腫瘤疾病的發(fā)展進(jìn)程，可作為腫瘤的無(wú)創(chuàng)液體活檢中重要的標(biāo)志物。外泌體的應(yīng)用主要在疾病治療、生物標(biāo)志物、藥物遞送等三大領(lǐng)域。

一、外泌體的提取與純化

如何高效、高純度地富集外泌體是實(shí)現(xiàn)其組學(xué)分析和功能研究的關(guān)鍵。然而外泌體體積小，密度低，加之在粒徑與組成方面存在異質(zhì)性，即使同種細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體也有可能形態(tài)各異，給外泌體的提取帶來(lái)巨大困難。如今已發(fā)展了多種基于外泌體尺寸、密度及免疫表型的提取方法，包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、尺寸排阻色譜、免疫親和法等^[1]。

圖1 常用的外泌體分離方法

1、超速離心法：首先在300、2000和10000g離心力作用下去除樣本中的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大囊泡，隨后在110000g條件下收集外泌體，最后用磷酸鹽緩沖液(PBS, abs962)清洗沉淀以去除可溶的干擾蛋白質(zhì)（圖1a）；

2、密度梯度離心法：屬于一種更為嚴(yán)格的超速離心法，能夠根據(jù)樣品密度進(jìn)一步純化囊泡，克服蛋白質(zhì)共沉淀造成的污染。常用的分離介質(zhì)包括碘克沙醇(abs44121314)和蔗糖(abs47050864)。以蔗糖為例，實(shí)際操作時(shí)，需要預(yù)先制備不同濃度梯度的蔗糖/D₂O(abs47051532)溶液，隨后加入待分離物質(zhì)。在超速離心力的作用下，外泌體將在等密度區(qū)域(1.13~1.19g/mL) 駐留，收集該組分即可得純化的外泌體（圖1b）；

3、尺寸排阻色譜法：以不同粒徑的聚合物凝膠填料作為分離介質(zhì)，基于尺寸特征實(shí)現(xiàn)外泌體的分離（圖1c）。色譜柱采用穩(wěn)定、多孔的凝膠顆粒填充，將含有外泌體的溶液加入到色譜柱中時(shí)，較小的顆粒將被捕獲在孔中，而較大的分子則不會(huì)進(jìn)入孔中并被先洗脫。因此，不同階段的洗脫部分將包含不同大小的分子，首先是較大的外泌體顆粒，其次是較小的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)顆粒(abs9777)；

4、超濾法：其原理與傳統(tǒng)的膜分離法相同。該方法通常選用相對(duì)分子截留量為100kDa 的超濾管，能夠在提取外泌體的同時(shí)濃縮樣本量，尤其適用于細(xì)胞培養(yǎng)液、尿液等大體積樣本（圖1d）；

5、親和法：親和提取法是目前特異性很好的一種外泌體提取方法，也是wei一一種能夠識(shí)別特定細(xì)胞來(lái)源的外泌體的方法。外泌體的親和提取主要通過(guò)抗體與外泌體膜蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用實(shí)現(xiàn)（圖1e）。所使用的抗體為單抗或多抗，目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是外泌體表面普遍具有的CD63(abs159125)、CD9(abs131217)、CD81(abs159270)等跨膜蛋白質(zhì)、膜聯(lián)蛋白質(zhì)和上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)等，也可以是癌細(xì)胞外泌體表面du有的標(biāo)志性蛋白質(zhì)；

6、基于聚合物的共沉淀法：聚合物沉淀法是商業(yè)化外泌體提取試劑盒通常采用的策略，其中聚乙二醇(abs42155612)是目前zui常用的沉淀試劑。一般認(rèn)為聚合物沉淀法的原理是聚合物通過(guò)“劫持"水分子，降低外泌體溶解度，進(jìn)而在低速離心條件下發(fā)生沉降（圖1f）。

二、外泌體的表征手段

目前可以通過(guò)電鏡、動(dòng)態(tài)光散射、納米顆粒跟蹤分析儀、蛋白質(zhì)免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞儀等對(duì)外泌體進(jìn)行表征。

通過(guò)電鏡可獲得外泌體的形態(tài)信息，不同類型的顯微鏡由于操作環(huán)境不同，得到的外泌體形態(tài)存在差異。例如，在掃描電鏡、透射電鏡和原子力顯微鏡中，外泌體呈現(xiàn)囊泡的茶托形（圖2a），可能由于樣品在固定或染色過(guò)程中極度脫水，導(dǎo)致外泌體塌陷所致。與之相反，在冷凍電鏡中外泌體呈現(xiàn)圓形，由于不會(huì)脫水變性，所得的外泌體形態(tài)可能更加接近囊泡的真實(shí)狀態(tài)（圖2b）。另外，由于透射電鏡和原子力顯微鏡具有較高分辨率，也能夠提供外泌體磷脂雙分子層厚度、粒徑分布等信息（圖2c）。

圖2a 掃描電鏡下外泌體呈現(xiàn)囊泡的茶托形^[2]。

圖2b 冷凍電鏡下外泌體呈現(xiàn)圓形，形態(tài)可能更加接近囊泡的真實(shí)狀態(tài)^[3]。

圖2c 透射/原子力電鏡下可觀察到外泌體磷脂雙分子層^[4]。

圖2  用不同類型顯微鏡觀察的外泌體形態(tài)

雖然目前幾種常用的表征方法尚有不足，但是多種方法結(jié)合能夠提高對(duì)外泌體的表征精度。隨著各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)外泌體的準(zhǔn)確、快速、可靠分析。

三、外泌體的示蹤技術(shù)

對(duì)分離的外泌體進(jìn)行體外標(biāo)記或體內(nèi)活體示蹤，有助于對(duì)外泌體的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。目前對(duì)于外泌體的標(biāo)記方法有很多種，如熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記、量子點(diǎn)標(biāo)記、免疫標(biāo)記、同位素標(biāo)記、基因標(biāo)記等。其中，熒光標(biāo)記由于操作簡(jiǎn)單方便，是科研人員zui常用的外泌體標(biāo)記方法。外泌體標(biāo)記熒光染料包括DiR(abs45153692)、DiI(abs42002237)、DiO(abs45153674)、DiD(abs47048165)等，其中DiR的近紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織，也常用于小動(dòng)物體內(nèi)示蹤。此外，標(biāo)記細(xì)胞膜的PKH26(abs9819)和PKH67(abs9820)試劑盒也被用于外泌體的標(biāo)記。

下面小愛(ài)就以文獻(xiàn)為例給大家詳細(xì)介紹DiR標(biāo)記外泌體并用于體內(nèi)示蹤的具體步驟^[5]。

1、準(zhǔn)備好分離純化的外泌體；

2、用2μM DiR(abs45153692)在37℃下標(biāo)記外泌體1h，然后用SuperEV 0.5純化柱純化。

3、將不同量的外泌體腹腔注射到小鼠體內(nèi)。注射24h后，將小鼠麻醉，并使用NIR-II Imaging System H成像系統(tǒng)成像。

為了進(jìn)一步分析外泌體在組織中的位置，對(duì)組織進(jìn)行篩選、固定和切片，并使用尼康TI2-E+A1 R共聚焦顯微鏡檢測(cè)DiR信號(hào)(Ex/Em = 748/780nm)。

圖3 外泌體(EVs)治療24h后，大多數(shù)熒光信號(hào)仍留在正常小鼠的注射部位(a)。相反，在EVs處理的AP小鼠中，熒光信號(hào)擴(kuò)散到腹部，胰腺顯示出比用F4/80- EVs治療的AP小鼠更強(qiáng)的熒光信號(hào)。

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[1] 高方園,焦豐龍,張養(yǎng)軍,等.外泌體分離技術(shù)及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].色譜, 2019, 37(10):13.

[2] Shao H, Im H, Castro C M, et al. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles[J]. Chemical Reviews, 2018, 118(4):1917.

[3] Li P, Kaslan M, Lee S H, et al. Progress in Exosome Isolation Techniques[J]. Theranostics, 2017,7(3):789.

[4] Pisitkun T, Shen R F, Knepper M A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(36): 13368.

[5] Gao Y, Mi N, Wu W, et al. Transfer of inflammatory mitochondria via extracellular vesicles from M1 macrophages induces ferroptosis of pancreatic beta cells in acute pancreatitis[J]. J Extracell Vesicles, 2024;13(2):e12410.

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