脂質染色 | 脂滴&膽固醇染色技術全攻略

脂質是一類廣泛存在于生物體中的有機分子，它們在細胞的結構和功能中扮演著重要角色。脂滴和膽固醇是脂質的不同形式，它們在結構和功能上有所不同。脂滴是中性脂的主要貯存場所，包括脂酰甘油和酯化膽固醇。在病理情況下，如器官發生脂肪變性，細胞內可能出現脂滴增多，通過脂肪染色能將這些脂滴清晰的顯現出來。膽固醇是真核細胞細胞膜的重要成分，能夠維持膜結構完整性，調節膜流動性，參與信號轉導，在動脈硬化、Ｃ型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C, NPC)、阿爾茨海默病等疾病的發生發展過程中起著重要作用。

脂滴和膽固醇的染色是病理學和細胞生物學研究中的重要技術，用于觀察和量化細胞內脂質的積累。目前，脂滴染色使用zui廣泛的染料包括油紅O(Oil Red O)、尼羅紅(Nile Red)、蘇丹染料(Sudan Dyes)等。膽固醇染色使用最多的染料是菲律平(Filipin III)，Filipin已被廣泛應用30余年。它可用于標記生物膜結構上及非細胞結構內的自由膽固醇，也能配合應用膽固醇酯化酶，使膽固醇酯水解成自由膽固醇而間接顯色。

接下來，小愛就給大家詳細介紹脂滴和膽固醇的染色方法。

一、脂滴染色

1、組織切片脂滴油紅O(abs42024259)染色

1）實驗原理

油紅O屬于偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結合呈小脂滴狀。脂溶性染料能溶于組織和細胞中的脂類，它在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當組織切片置入染液時，染料則離開染液而溶于組織內的脂質（如脂滴）中，使組織內的脂滴呈橘紅色。

2）染色步驟^[1]

① 油紅O染色液配制：

a.母液準備：稱取1g油紅O，加入100mL異內醇配置成儲存液，棕色瓶4℃密封保存。

b.工作液準備：使用前加雙蒸水稀釋至60%，濾紙過濾后使用。

② 用冰凍切片機切取5μm厚的肝組織切片；

③ 用95%乙醇固定，蒸餾水清洗1min，60%異丙醇浸泡30min；

④ 再用60%油紅O染色溶液處理10min和15min，蒸餾水沖洗1min；

⑤ 蘇木素復染，用自來水清洗1~3min，光鏡下觀察肝細胞脂質沉積情況。

3）肝組織油紅O染色結果圖：

（注：圖片來源于文獻[1]）

2、細胞脂滴尼羅紅(abs9114)染色（以下染色方法僅供參考）

1）實驗原理

尼羅紅是一種親脂性熒光染色劑，它是一類環境敏感性熒光染料，能夠在富含脂質的環境中產生強烈的熒光，而在水性介質中的熒光強度極小，這種特性使得它成為了一款極重要檢測細胞內脂滴的熒光指示劑，可以通過熒光顯微鏡和流式細胞檢測結果。

2）染色步驟

① 尼羅紅染色液配制：

a.母液準備：取適量的尼羅紅（Mw：318.37g/mol）用無水DMSO充分溶解制備1mM儲存液，按照單次用量分裝凍存，避免反復凍融，避光保存。

b.工作液準備：用HHBS或生理緩沖液(pH 7.0)將母液按1:1000稀釋為1×尼羅紅工作液，漩渦混勻。

【注意】：

尼羅紅的實際染色濃度請參考文獻或實驗室體系來調整。以上只做參考。

② 用檢測化合物處理細胞一段時間；

③ 離心并調整細胞濃度為1-5×10⁵cell/管；

④ 用500µL尼羅紅工作液重懸細胞；

⑤ 室溫或37oC避光孵育5-10min；

⑥ 吸掉染色工作液，用HHBS或適當緩沖液清洗細胞；

⑦ 用500µL預熱的HHBS或培養基重懸細胞，使細胞密度為1-5×10⁵cell/管；

⑧ 熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測熒光信號，Ex/Em=552/636nm。

【注意】：

① 對于貼壁細胞，可用HHBS或適當緩沖液清洗細胞，然后直接加入尼羅紅工作液孵育；

② 細胞也可預固定，然后用尼羅紅工作液染色。

二、膽固醇染色

細胞膽固醇菲律平(Filipin III, abs42018484)染色

1）實驗原理

菲律平的主要成分是Filipin III，它可以特異性地與游離膽固醇相互作用，而不與酯化的膽固醇結合。這種特異性結合是由于菲律平分子結構中包含多個共軛雙鍵，使其能夠與膽固醇分子的疏水部分形成復合物。當Filipin III與游離膽固醇結合后，其激發光譜波峰約在360nm處，發射光譜波峰約在480nm處。通過檢測這些特定波長附近的熒光信號，可以表征細胞內的膽固醇含量。

2）染色步驟^[2]

① 菲律平染色液配制：

a.母液準備：1mg菲律平粉末中加入1mL DMSO，完quan溶解配置成1mg/mL儲存液，按照單次用量分裝凍存，避免反復凍融，避光保存。

b.工作液準備：使用前，取適量母液加入到PBS中，稀釋成一定濃度的工作液（如0.1mg/mL）備用。

② 將細胞接種于蓋玻片中，培養12-18h；

③ 用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，在室溫下用4%多聚甲醛固定20min；

④ 室溫下用0.1mg/mL菲律平III處理細胞30min；

⑤ 細胞再用0.35μg/mL碘化丙啶(PI)染色5min；

⑥ 最后，用共聚焦激光掃描顯微鏡在405nm處檢測菲律平和PI染色的熒光強度。

3）星形膠質細胞/神經元細胞菲律平染色結果圖

（注：圖片來源于文獻[2]）

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[1] Ji X, Ma Q, Wang X, et al. Digeda-4 decoction and its disassembled prescriptions improve dyslipidemia and apoptosis by regulating AMPK/SIRT1 pathway on tyloxapol-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice[J]. J Ethnopharmacol. 2023;317:116827.

[2] Huang Y, Zhang W, Guo X, et al. Cellular cholesterol loss by DHCR24 knockdown leads to Aβ production by changing APP intracellular localization[J]. J Lipid Res. 2023;64(5):100367.

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