分子生物學實驗“酶”你不行！

做了這么多年的分子實驗，對于其中的工具酶大家都了解嗎？他們的作用原理都知道嗎？本期Absin分子小課堂小愛要教大家如何分清這些復雜的酶。

工具酶是一類在DNA重組過程中，用于不同DNA分子的制備、切割、修飾、擴增、核酸分子的標記以及核苷酸序列測定的酶的統稱，是基因重組技術所需的工具。根據催化反應特性可分為限制性內切酶、聚合酶、連接酶、逆轉錄酶等多種類型。

限制性內切酶

限制性內切酶主要從原核生物中發現，以內切方式水解核酸中磷酸二酯鍵，對外源性的DNA進行切割、水解，被稱為“基因剪刀"。限制酶來源于細菌的“限制—修飾"系統，最早發現于20世紀60年代末。根據限制酶的結構與作用方式，可將其分為Ⅰ類限制酶(TypeⅠ)、Ⅱ類限制酶(TypeⅡ)和Ⅲ類限制酶(TypeⅢ)3種類型。其中，Ⅱ類限制酶識別切割位點比較專一，且不具有甲基化酶的活性，在DNA重組中被廣泛應用。

愛必信擁有不同的TypeⅡ型限制性內切酶產品：

產品優勢：

1、快速：5-15min內即可完成酶切；

2、便捷：共用一種酶切Buffer，簡化酶切體系；

3、兼容性高：在不同緩沖液中均具有很高活性；

4、良好酶活冗余度，輕松應對底物過量或困難模板酶切。

DNA連接酶

DNA連接酶主要用于基因工程中，將由限制性核酸內切酶“剪"出的粘性末端重新組，故也稱“基因針線"。作用原理為DNA連接酶催化雙鏈DNA鏈一條鏈上切口的連接，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-Po4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。T4 DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，可催化雙鏈DNA的粘性末端、平末端及RNA-DNA雜合體中單鏈的連接，在分子生物學中有廣泛的應用。

DNA聚合酶(DNA polymerase)

DNA聚合酶以DNA為復制模板，從將DNA由5'端點開始復制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。實驗室常用的DNA聚合酶有普通耐熱型Taq DNA聚合酶、高保真型DNA聚合酶。

逆轉錄酶

逆轉錄酶（反轉錄酶）又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。該酶以RNA為模板，以dNTP為底物，根據堿基配對的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA (complementary DNA, CDNA)。

核酸酶

核酸酶主要有三類，分別是：

1、脫氧核糖核酸酶(DNase)：DNase只能水解DNA的磷酸二酯鍵。胰DNasel可切割雙鏈和單鏈DNA，產物為5’-磷酸寡核首酸，牛脾DNasell降解DNA則產生3’-磷酸為未端的寡核苷酸；

2、核糖核酸酶(RNase)：將RNA降解為小片段的核酸酶；

3、非特異性核酸酶：將DNA、RNA都可進行水解。

其他酶

FAQ：

1、限制性內切酶無法切割DNA有哪些原因？

a. 內切酶失活：用標準底物檢測酶活性；

b. DNA不純，含有SDS、酚、EDTA等內切酶抑制因子：將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA；

c. 條件不適（試劑、溫度）：檢查反應系統是否最佳；

d. DNA不存在該酶識別序列：換用其它的酶切割DNA或過量酶消化驗證。

2、酶切后的DNA片段連接效率低？

a. 含磷酸鹽的濃度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽；

b. 內切酶失活或含有ATP酶：更換內切酶；

c. 平末端連接：加大T4 DNA Ligase用量；

d. 連接緩沖液不合適：重新配制連接緩沖液。

3、脫氧核糖核酸酶I(abs60539)濃度、體積怎么換算？用于組織的解離該怎么用？

對于濃度、體積計算：本產品規格為1KU，酶活濃度是5U/mL，總體積則為200uL。根據說明書最后一個表格計算酶體積用量：例如1ugRNA，相應所需酶就是1U，1KU/1U=200uL/需要體積，最后計算得到0.2uL。對于動物組織解離，可以適用，具體操作步驟及使用量可參考網絡文獻。

4、pfAgo核酸內切酶buffer是否含有金屬離子？

Buffer中不含金屬離子，對于擴增反應沒有任何影響。一般PfAgo酶可以兼容絕大多數PCR buffer，但普通Taq酶不兼容PfAgo buffer。

5、pfAgo核酸內切酶和Ago核酸內切酶（微球）有哪些差別？

兩者狀態不一樣、保存條件不一樣；檢測方法、使用的效果幾乎一樣。

名詞解釋：

酶活性單位：在一定溫度、PH及離子強度下，1h內酶解（切割）特定底物DNA，所需酶的量。采用國際單位（IU，簡寫為U）來統一表示酶活性的大小。

酶活性濃度：以每單位體積所含的酶活性單位數表示。目前幾乎都習慣用U/L來表示液體中酶活性濃度。

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