類器官原位活死染色實驗攻略

概述

在類器官的培養過程中，如果我們想了解類器官的增殖及凋亡狀態，可以通過對活細胞和死細胞進行熒光染色，通過熒光顯微鏡拍照觀察。

Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發綠色熒光 (Ex=490nm, Em=515nm)。因其在傳統的Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發熒光）被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein-AM細胞毒性極低，是很適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。        

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。因此，Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶(PI)等聯合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化丙啶(Propidium iodide, PI)不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光(Ex=535nm, Em=617nm)，因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545nm激發，僅可觀察到死細胞。

原理

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色標記，從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據我司優化的實驗體系，以24孔板，每孔25uL類器官基質膠凝聚物為例，每孔添加500uL染色工作液進行染色。

活細胞/死細胞雙染試劑盒(abs50056)

實驗步驟

一、工作液的配制：

1、1×Assay Buffer（反應緩沖液）的配制 從低溫冰箱內取出10×Assay Buffer，根據單次用量無菌條件取出適量，用去離子水(dH₂O)做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

2、1×染色工作液的配制

（1）先將低溫保存的Calcein-AM溶液(2mM)和PI溶液(1.5mM)回到室溫20-30min。 注意：第一次使用可對母液進行分裝，以減少反復凍融次數。

（2）取5μL Calcein-AM溶液(2mM)和15μL PI 溶液(1.5mM)加入5mL 1×Assay Buffer，充分混勻。此時得到Calcein-AM的工作液濃度為2μM，PI的工作液濃度為4.5μM。

注意：由于不同種類器官的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用min的探針濃度得到較好的熒光結果。可以使用以下方法來優化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。

a. 用0.1%皂素或者0.1-0.5%digoxin孵育類器官1h，或者用70%乙醇孵育類器官1h，從而制備死類器官；

b. 用0.1-10μM的PI溶液進行死類器官染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質染色的最佳工作濃度；

c. 用0.1-10μM的Calcein-AM進行死類器官染色，以得到不會對細胞質染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色，去觀察活細胞是否能被染色。

二、染色步驟：

 以24孔板，每孔25uL類器官基質膠凝聚物為例，檢測時只需棄除類器官培養液，保留孔板內25μL類器官基質膠凝聚物，加入染色工作液即可。

1、將類器官培養基吸棄，加入PBS清洗2-3遍，以充分去除殘留的酯酶活性，然后棄除PBS；

2、每孔加入500μL染色工作液，混勻，37℃孵育1h；

3、熒光顯微鏡下使用490±10nm激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行檢測。

注意事項

1、由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量，分裝密封保存。

2、由于Calcein-AM的穩定性比較差，此染色工作液必須現配現用，并且在當天用完。

3、碘化丙啶(PI)有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。

4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

染色效果圖展示

一、人肝細胞癌類器官明場圖

人肝細胞癌類器官擴增過程（由少到多）

二、人肝細胞癌類器官活死染色視頻

三、人肝細胞癌類器官活死染色圖

人肝細胞癌類器官活細胞、死細胞、活死細胞染色合并圖

人肝細胞癌類器官活死細胞染色合并圖

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎私聊交流哦！

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