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                文獻解讀 | 原來CD63才是外泌體特異性標志性蛋白,而CD9和CD81并不特異

                更新時間:2024-03-28      點擊次數(shù):855

                摘要:

                 

                盡管細胞外囊泡(EVs)在細胞間通訊中發(fā)揮作用,但它們的不同種群及其分泌機制尚未表征:EVs如何以及在何種程度上形成為內(nèi)吞隔室腔內(nèi)囊泡(外泌體)或在質(zhì)膜(PM)上形成囊泡(ectosomes)仍不清楚。該研究跟蹤了EV標志物CD9和CD63從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到它們的駐留區(qū)室,分別是PM和晚期內(nèi)體的細胞內(nèi)運輸。在它們最終分離之前,觀察到兩個地方的瞬時共定位。CD9和穩(wěn)定在PM的突變CD63在EV中比CD63更豐富地釋放。因此,在HeLa細胞中,ectosomes比外泌體分泌更多。通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析和對內(nèi)體pH中和的差異反應(yīng),確定了一些可能對外泌體(LAMP1)或ectosomes(BSG、SLC3A2)具有特異性的表面蛋白。該研究工作為任何細胞類型中外泌體和小ectosomes的分子和功能區(qū)分開辟了道路。

                 

                引言:

                 

                所有細胞都會在其環(huán)境中釋放膜包裹的囊泡,統(tǒng)稱為細胞外囊泡(EV)。這些EV包含來自其起源細胞的一組選定的脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì),因此可以將一系列復(fù)雜的信息傳輸?shù)街車蜻h處的細胞。EV可以通過從原核和真核細胞的質(zhì)膜(PM)直接向外出芽形成。在真核細胞中,EV也可以首先作為內(nèi)吞途徑(MVB)的內(nèi)部多泡隔室的腔內(nèi)囊泡形成,然后在這些隔室與PM融合時分泌。為了闡明命名法,最近建議專門針對MVB衍生的EV使用術(shù)語“外泌體",而不是針對所有小型EV;另一方面,PM衍生的EV被稱為各種名稱,例如微泡、微粒或胞外體。

                 

                由于它們在不同的亞細胞位點形成,外泌體和胞外體可能包含不同組的特定貨物,因此具有不同的功能。然而,由于難以將生物流體或細胞條件培養(yǎng)基中存在的相同大小的外泌體與外泌體分離,缺乏區(qū)分外泌體與胞外體的特異性蛋白質(zhì)標記,以及分子機制和具有對一個或另一個特異性的工具。

                 

                研究結(jié)果:

                 

                1、CD63和CD9存在于兩個不同的和一個共同的EV群體中

                 

                使用HeLa細胞去研究分析EV的分布,免疫熒光結(jié)果表明CD63主要位于細胞內(nèi)區(qū)室中。相反,CD9主要存在于質(zhì)膜上,但也存在于罕見的暗淡細胞內(nèi)區(qū)室中。在穩(wěn)態(tài)下沒有觀察到兩種蛋白質(zhì)的明顯共定位。

                 

                 

                2、CD63和CD9短暫地通過晚期內(nèi)體和PM

                 

                pHluorin在酸性條件下實際上是無熒光的,但在中性pH時發(fā)出熒光,因此使其成為觀察酸性晚期胞內(nèi)MVB與質(zhì)膜融合的理想報告分子。由于細胞外部環(huán)境處于中性pH,因此在融合過程中會發(fā)生酸到中性的轉(zhuǎn)換。免疫電鏡表明在所有時間點,大多數(shù)MVB和溶酶體僅包含CD63而不是CD9。

                 

                 

                3、與CD63不同,CD9和CD63-YA具有相似的PM定位和內(nèi)化動力學(xué)

                 

                溶酶體靶向基序進行突變?yōu)镃D63-YA,CD63-WT-eGFP或CD63-YA-eGFP RUSH質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細胞;結(jié)果顯示,在穩(wěn)定狀態(tài)下,與CD63-WT相反,CD63-YA主要位于細胞外圍和一些小的細胞內(nèi)區(qū)室中。動力監(jiān)測結(jié)果顯示,突變體CD63-YA 不會進入酸性內(nèi)部隔間;同時,用生物素處理后,結(jié)果顯示CD9和CD63-YA在添加生物素后約1h達到相似的表面(AF647)/總(GFP)熒光強度比為1,在穩(wěn)態(tài)下進一步增加至約2;相比之下,對于CD63,最大表面/總比值增加但保持低于1,直到添加生物素后2h,并在2h和穩(wěn)態(tài)之間下降,CD63-YA和CD9表現(xiàn)相似并在質(zhì)膜上積累。

                 

                 

                4、PM蛋白在CD9-EV中富集,而內(nèi)體/溶酶體和PM跨膜蛋白都在CD63-EV中富集

                 

                為了更好地確定CD63+和CD9+EV的起源,并鑒定PM或內(nèi)體釋放的EV的特定標志物,研究者進行了定量質(zhì)譜分析;同步分泌的CD63或CD9 EV的定量質(zhì)譜分析揭示了質(zhì)膜和內(nèi)體衍生的EV的特征,PM蛋白在CD9-EV中富集,而內(nèi)體/溶酶體和PM 跨膜蛋白都在CD63-EV中富集。

                 

                 

                研究結(jié)論:

                 

                這項工作旨在確定含有不同四跨膜蛋白的EV的實際外泌體或外泌體性質(zhì)。為了確定這些細胞釋放的EV的亞細胞起源,研究者通過時間控制的方式跟蹤四跨膜蛋白的細胞內(nèi)運輸,從它們在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的初始合成到它們在EV中的分泌。研究結(jié)果表明,CD63和CD9都可以在質(zhì)膜形成的小ectosomes中釋放,并且在HeLa細胞中,外泌體代表小EVs(sEVs)的一個小亞群,它們攜帶CD63和其他晚期內(nèi)體分子,如LAMP1/2。它們的分泌特別容易受到內(nèi)體pH值的中和。BSG和SLC3A2被鑒定為HeLa細胞中ectosomes分泌的特定標記物,相反對內(nèi)體pH中和不敏感。有趣的是,CD81是另一種常用作外泌體和/或小EV標記物的四跨膜蛋白,其行為類似于CD9而不是CD63。此處確定的外泌體與ectosomes的特異性標志物和分子機制將為進一步研究以破譯它們各自的功能鋪平道路。


                參考文獻:


                標題:Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9

                期刊:Nat Commun

                發(fā)表時間:2021年

                影響因子:17.694

                 

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                abs9775

                外泌體提取試劑盒

                1mL

                abs9777

                外泌體純化試劑盒(SEC)

                1mL

                abs50039

                血漿血清外泌體提取試劑盒

                20T

                abs50040

                細胞上清外泌體提取試劑盒

                20T

                abs132700

                Rabbit anti-CD63 Polyclonal Antibody

                50ug

                abs102483

                Rabbit anti-CD9 Polyclonal Antibody(Center)

                50uL

                abs06006

                Recombinant Human CD81 Protein(C-10His)

                50ug




                 

                Absin特色產(chǎn)品線:

                WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

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