基質膠實驗應用攻略大全

概述

基質膠是從小鼠腫瘤組織提取的基底膜成分（基底膜是動物體內上皮細胞基底面的一層基質膜），所形成的基質膠?；|膠主要成分為層粘連蛋白，Ⅳ型膠原蛋白，巢蛋白。同時，基質膠也包含多種生長因子，例如表皮生長因子EFG，血小板衍生生長因子PDGF，神經生長因子NGF，堿性成纖維細胞生長因子FGF-2，乙型轉化生長因子TGF-beta和胰島素樣生長因子ILGF（Vukicevic et al.1992）。

基底膜在小鼠腫瘤組織中的位置分布

基質膠在各實驗領域中的應用

1、小鼠成瘤實驗

動物實驗由于其更能模擬人類的生理和病理條件，在腫瘤研究中，最常規的動物實驗就是裸鼠成瘤實驗。由于大部分腫瘤研究使用的是人類細胞，所以由于異種排斥的存在，我們需要免疫缺陷型小鼠來作為移植瘤模型的載體，通過對該小鼠的注射腫瘤細胞，使其成瘤，觀察流體的生長來判斷其生物學變化。

試劑材料

基質膠（高濃度，無酚紅）(abs9493)

操作步驟

1）收集用于注射小鼠的細胞5*10⁶個，以1:1的體積與基質膠混合，為方便注射，建議每次注射總體積不低于100µL；

2）用脫毛器對小鼠注射部位皮膚進行脫毛，然后用酒精棉球進行消毒；

3）用不帶針頭的1mL注射器將細胞和膠的混合物吸入針頭，再裝上16g的針頭（針頭內直徑為1.194mm）， 將混合物注射到皮下，或者大腿肌肉（針對代謝特別旺盛的腫瘤細胞）。

注意事項：

1）動物選擇：一般選擇4-6周齡Nude裸鼠，需要提前到SPF環境中適應1周；

2）接種部位與接種量：接種部位常為皮下，靜脈或原位；細胞量一般是5*10⁶個/200µL，但是不同的細胞系的接種量略有差別；

3）成瘤時間：皮下接種的細胞一般會在1-2周成瘤，一般不會超過1個月；尾靜脈和腹腔接種的細胞一般也是1周左右，需要密切觀察動物的體重與狀態進行判斷；

4）注射的時候一定要注意別打漏了或者打到肌肉里，這樣出來的瘤體積一致性很差。一般采用進針以后針尖向上挑，打的體積不超過200µL。

基質膠成瘤對比實驗

使用Absin高濃度基質膠，小鼠皮下瘤體積后期顯著高于對照組和C品牌。

2、類器官培養

類器官屬于三維(3D)細胞培養物，包含其代表器官的一些關鍵特性。此類體外培養系統包括一個自我更新干細胞群，可分化為多個器官器官特異性的細胞類型，與對應的器官擁有類似的空間組織并能夠重現對應器官的部分功能，從而提供一個高度生理相關系統。類器官可以從成體干細胞(ASCs)、多能干細胞(PSCs)（即胚胎干細胞或ESCs），或誘導的PSCs(iPSCs)中衍生。類器官培養系統主要包括基質膠、維持類器官生態所需因子和分化所需因子這幾個主要元素?；|膠中含有膠原、巢蛋白和纖連蛋白等等，為類器官形成三維空間結構提供基質。維持類器官生態因子主要目的為促進細胞的增殖和抑制細胞凋亡等。

類器官培養流程

以人腸癌類器官培養為例

試劑耗材

人腸癌類器官培養基試劑盒(abs9445)、基質膠（低因子、無酚紅）(abs9495)、60mm細胞培養皿(abs7005)、100μm濾篩(abs7009)、15mL離心管(abs7102)、1.5mL EP管若干(abs7119)、24孔細胞培養板(abs7058)、金屬冰盒、眼科剪刀、眼科鑷

人腸癌類器官培養基試劑盒(abs9445)

試劑盒組成

基質膠（低因子、無酚紅）(abs9495)

操作步驟

1）類器官操作流程之——樣本準備

a.將組織放入含有預冷的（2-8°C）組織保存液E的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫院/實驗室取回；

b.將取樣瓶消毒，組織取出放入培養皿樣本拍照，并登記大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。

2）類器官操作流程之——清洗-剪碎

在60mm細胞培養皿(abs7005)里用2-3mL原代培養緩沖液B浸泡。用原代培養緩沖液B清洗三次（每次更換培養皿）后剪碎，剪成大約1-3mm³的組織塊，轉移至15mL離心管。

3）類器官操作流程之——消化-過濾

a.向15mL離心管中加入人腸癌原代組織消化液C（消化液是組織體積的3-5倍）在37℃進行消化10-15min（消化過程中隨時觀察消化情況）；

b.取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的細胞團（5-10個細胞抱團）后， 加入3倍體積原代培養緩沖液B終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁；

c.使用100μm濾篩(abs7009)進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察。將濾液收集到15mL離心管，于300g 4℃富集離心5min后移去上清，添加1mL左右原代培養緩沖液B轉移到1.5mL EP管，重新重懸離心。

4）類器官操作流程之—離心、加膠

基質膠計算：第3步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠(abs9495)重懸鋪板（金屬冰盒或冰上操作）。

5）類器官操作流程之——點膠-加液

以24孔細胞培養板為例，每孔點膠25uL組織基質膠混合物進行鋪板（金屬冰盒或冰上操作），將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養基A進行培養。

類器官培養對比

使用Absin低因子基質膠，腸癌類器官數量和體積顯著大于某進口品牌。

使用Absin低因子基質膠，腸癌類器官數量顯著大于友商品牌且熒光染色類器官形態更完整。人膽管類器官由細胞核染料DAPI（藍色），緊密連接蛋白抗體anti-ZO1和細胞骨架蛋白F-actin的染料 Alexa Fluor 647 Phalloidin染色成像。

使用Absin低因子基質膠，肝癌類器官染色效果和友商品牌效果相當。肝癌類器官由細胞核染料DAPI（藍色），肝臟細胞生物標志物HNF4a和肝癌標志物GPC3的抗體染色成像。

3、血管生成實驗

血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛細血管和毛細血管后微靜脈新的毛細血管性血管的生長。血管生成參與了需對疾病的病理變化，無論原發性腫瘤還是繼發性腫瘤，一日生長直徑超過1-2mm，都會有血管生成。這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子誘導血管生成。控制血管生成有利于多種疾病的治療，從病理學角度研究疾病狀態下的血管生成和消退規律，采取有效的血管治療策略以及開展器官轉移等研究均有十分重要的意義。其中小管形成實驗是測量在體外血管生成一種快速的可量化的方法。

以永生化HUVEC細胞系為例：

試劑材料

基質膠（標準型，無酚紅）(abs9491)、胎牛血清(abs972)、HUVEC細胞(5*10⁴ per well)、96孔細胞培養板(abs7036)、青霉素-鏈霉素溶液（100×，雙抗）(abs9244)、DMEM高糖培養基（含L-谷氨酰胺，含丙酮酸鈉，不含HEPES）(abs9483)

實驗步驟

1）將培養基換成饑餓細胞用培養基：加入含0.2% FBS，1%雙抗的DMEM培養基培養24h；

2）將基質膠均勻鋪滿96孔板底。

注意：槍頭需提前預冷30min。盡量在冰上操作，避免基質膠過早固化，避免氣泡產生；

3）將96孔板在細胞培養箱孵育30min，固化基質膠；

4）消化HUVEC細胞，并計數；

5）將200µL的HUVEC細胞懸液（含5*10⁴個細胞）加于含基質膠的96孔板中。將96孔板放于培養箱；

6）血管樣網絡結構將于3-12h形成；

7）在血管網絡形成最佳時間，小心去除培養基，并用加入含活細胞染料1/1000 Calcein AM（綠色）的培養基進行染色，并用顯微鏡進行拍照記錄。

使用Absin標準型基質膠以及外友商基質膠，均可使人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)形成血管網絡。

4、細胞侵襲

Transwell細胞體外侵襲實驗應用于各種細胞因子對惡性腫瘤細胞侵襲和轉移的影響及一些抑制血管生成的新藥研究。Transwell實驗原理就是將transwell小室放入培養板中，并將高營養液與低營養液用一層膜隔開，細胞放在低營養液中，而為了獲得更多的營養，細胞則會穿過這層膜，進入高營養液。細胞transwell實驗，可作為一種非常簡便的研究腫瘤細胞遷移、侵襲以及轉移情況的方法。

細胞侵襲實驗原理圖

實驗材料

基質膠（標準型，無酚紅）(abs9491)、胎牛血清(abs972)、PBS(abs962)、BSA(abs9156)、DMEM高糖培養基（含L-谷氨酰胺，含丙酮酸鈉，不含HEPES）(abs9483)、24孔板細胞培養小室配套培養板(abs7282)、上層培養液：DMEM加入0.05%-0.2%BSA、下層培養液：DMEM加入5%-10%FBS

實驗步驟

1）鋪基質膠：在4℃條件下將基質膠用無血清的細胞培養基或PBS緩沖液按照1:8比例稀釋（其稀釋比例需要摸索，選擇一個細胞穿過適中的濃度即可），取100uL均勻涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5-1h，使其聚合成凝膠。

注意：

a.將槍頭沿小室內壁將基質膠輕輕打出，切忌戳到小室濾膜；

b.加入的基質膠的體積不可太大。把聚碳酸酯膜浸濕即可；

c.注意低溫，槍頭、小室等都應該4℃預冷。

2）細胞培養：取對數生長期的待測細胞，并用PBS洗滌，接著用上層培養基（DMEM加入0.05%-0.2%BSA）懸浮細胞，調整細胞密度為1-10*10⁵/mL。

3）接種細胞：在24孔板下室一般加入500-650uL下層培養液（DMEM加入5%-10%FBS），然后用鑷子將Transwell小室置于24孔板內，取細胞懸液100-200µL加入上室，最后放入培養箱中培養12-48h（根據癌細胞的轉移能力而定）。

注意：

a.盡量避免氣泡的產生：下層培養液和小室間常會有氣泡產生，會影響下層培養液的趨化作用。因此一旦出現大氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板；

b.注意細胞一定要接種均勻，建議沿著壁緩慢加入；

c.時間點的選擇除了要考慮到細胞的轉移能力以外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視如某些藥物會抑制細胞的增殖。

4）細胞固定：取出小室，吸走培養基，用棉簽輕輕擦拭基質膠和上室內的細胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600µL，將小室放入后固定20-30min。

5）細胞染色及計數：棄固定液，用0.1%-0.2%結晶紫染色5-10min， PBS洗3遍，除去未與細胞結合的結晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側，將非特異性結合于小室上表面的染料擦掉，以便后續鏡檢。適當風千后，在高倍顯微鏡下選取5個視野觀察細胞并計數。

常見細胞每孔接種數量推薦（僅參考）

5、細胞遷移

細胞遷移和細胞侵襲實驗方法相似，區別點在于細胞遷移不需要基質膠包被。

細胞遷移實驗原理圖

實驗試劑

胎牛血清(abs972)、DMEM(abs9483)、PBS(abs962)、BSA(abs9156)、24孔板細胞培養小室配套培養板(abs7282)、上層培養液：DMEM加入0.05%-0.2%BSA、下層培養液：DMEM加入5%-10%FBS

實驗步驟

1）細胞培養：取對數生長期的待測細胞，并用PBS洗滌，接著用上層培養基（DMEM加入0.05%-0.2%BSA）懸浮細胞，調整細胞密度為1-10*10⁵/mL。

2）接種細胞：在24孔板下室一般加入500-650uL下層培養液（DMEM加入5%-10%FBS）（有些特殊實驗可以加趨化因子）。然后用鑷子將Transwell小室置于24孔板內，取細胞懸液100-200µL加入上室，最后放入培養箱中培養12-48h（根據癌細胞的轉移能力而定）。

注意：

a.盡量避免氣泡的產生:下層培養液和小室間常會有氣泡產生，會影響下層培養液的趨化作用。因此一旦出現大氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板；

b.注意細胞一定要接種均勻，建議沿著壁緩慢加入；

c.時間點的選擇除了要考慮到細胞的轉移能力以外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視如某些藥物會抑制細胞的增殖。

3）細胞固定：取出小室，吸走培養基，用棉簽輕輕擦拭上室內的細胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600µL，將小室放入后固定20-30min。

4）細胞染色及計數：棄固定液，用0.1%-0.2%結晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未與細胞結合的結晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側，將非特異性結合于小室上表面的染料擦掉，以便后續鏡檢。適當風千后，在高倍顯微鏡下選取5個視野觀察細胞并計數。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎公眾號“愛必信生物"后臺私信留言交流哦！

*注：文中部分圖源于網絡，僅供學習參考用。

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