國自然熱點(diǎn)研究 | 細(xì)胞銅死亡與癌癥治療

背景介紹

自2022年麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究所的Peter Tsvetkov和Todd R. Golub團(tuán)隊(duì)在《Science》上發(fā)表論文“Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins"后，一種由銅引起的細(xì)胞死亡新形式—銅死亡逐漸成為科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。

銅 (Copper, Cu) 作為一種必需的微量營養(yǎng)素，在促進(jìn)代謝和維持各種基本生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。人體內(nèi)銅的穩(wěn)態(tài)受到嚴(yán)格調(diào)控，銅穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致代謝異常并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。銅死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的由細(xì)胞內(nèi)過量銅引起的程序性細(xì)胞死亡形式，不同于其他已知的細(xì)胞死亡途徑（如細(xì)胞凋亡、壞死、焦亡和鐵死亡），在癌癥治療中顯示出巨大的潛力。

銅代謝過程

生物體系中的銅通常以Cu⁺和Cu²⁺兩種氧化態(tài)存在，銅的生物學(xué)功能與其在氧化形式和還原形式之間循環(huán)的能力密切相關(guān)。銅主要可從器官肉類和貝類等食物中獲得，成年人推薦的銅攝入量為0.8~2.4 mg/d用以維持全身銅穩(wěn)態(tài)。然而，過量或不足的銅水平會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性和病理改變。因此，必須將系統(tǒng)銅水平保持在一定的范圍內(nèi)。

膳食中銅的吸收主要發(fā)生在十二指腸和小腸，腸上皮細(xì)胞對(duì)銅的吸收依賴于銅轉(zhuǎn)運(yùn)體1 (Cu transport protein 1, CTR1)，前列腺六段跨膜上皮抗原可作為銅還原酶維持銅的還原狀態(tài)，促進(jìn)CTR1依賴的銅攝取。通過ATP7A介導(dǎo)，銅被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液，并與銅伴侶蛋白（銅藍(lán)蛋白、血清白蛋白、組氨酸等）結(jié)合。銅通過門靜脈系統(tǒng)被運(yùn)送到肝臟（肝臟是銅穩(wěn)態(tài)的中央控制系統(tǒng)，也是銅儲(chǔ)存和銅排泄的主要器官），由金屬硫蛋白1和2螯合以儲(chǔ)存在肝細(xì)胞中。通過ATP7B介導(dǎo)，銅被釋放到血液中，再次與可溶的伴侶蛋白結(jié)合，并被運(yùn)輸?shù)教囟ǖ慕M織和器官。到達(dá)其靶組織后，銅催化各種生理過程中的反應(yīng)，包括線粒體能量產(chǎn)生、酪氨酸和神經(jīng)遞質(zhì)代謝、氧化還原穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等。過量的銅通過膽汁排泄（內(nèi)源性銅消除的主要形式）或作為未吸收的金屬離子從糞便中排出。因此，體內(nèi)銅的狀態(tài)受腸道吸收、肝臟儲(chǔ)存和膽汁排泄動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。

圖1 正常生理狀態(tài)下的銅穩(wěn)態(tài)^[1]

在細(xì)胞質(zhì)中，通過銅伴侶蛋白協(xié)調(diào)作用，銅主要通過五種途徑調(diào)控其分布并發(fā)揮生物功能：

a. 以谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 為載體，銅被傳遞給金屬硫蛋白；

b. 抗氧化劑1銅伴侶蛋白在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到ATP7A和ATP7B，調(diào)節(jié)銅穩(wěn)態(tài)；

c. 銅被傳遞到細(xì)胞核，其中的Sp1鋅指結(jié)構(gòu)作為銅傳感器調(diào)節(jié)CTR1的表達(dá)；

d. 超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到超氧化物歧化酶1，以清除自由基；

e. 細(xì)胞色素C氧化酶銅伴侶蛋白將銅從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)骄€粒體，參與氧化磷酸化和線粒體功能的維持。當(dāng)銅的穩(wěn)態(tài)失調(diào)時(shí)，就會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的疾病，如門克斯病和威爾遜病。此外，銅缺乏也存在于阿爾茨海默病、帕金森病、非酒精性脂肪肝、糖尿病和肥胖等疾病中。

銅水平與癌癥的關(guān)系

研究表明，乳腺癌、肺癌、胃癌、甲狀腺癌和前列腺癌等癌癥患者腫瘤部位和血清中的銅水平明顯升高^[2]。銅通過結(jié)合和激活多個(gè)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子影響腫瘤發(fā)生、血管生成、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

圖2 銅水平與癌癥的關(guān)系^[1]

銅可以作用于受體酪氨酸激酶相關(guān)信號(hào)通路、磷酸肌醇-3-激酶信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。此外，銅作為一種“開關(guān)"血管生成信使，可以激活腫瘤壞死因子等血管生成因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1，促進(jìn)炎性新生血管的形成。銅還可以通過激活與轉(zhuǎn)移相關(guān)的酶和信號(hào)級(jí)聯(lián)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。此外，銅還可以調(diào)節(jié)磷酸二酯酶3B調(diào)節(jié)腫瘤代謝。因此，銅可以作為抗腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

銅離子檢測(cè)在胃癌治療中的應(yīng)用

2023年10月20日，上海市第一人民醫(yī)院黃陳教授和范廣建教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為“Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer"的研究論文。研究揭示了METTL16調(diào)控胃癌細(xì)胞銅死亡的分子機(jī)制，闡明乳酰化修飾及m6A修飾在胃癌進(jìn)展中的重要意義，為胃癌的治療提供新的靶標(biāo)和策略。

圖3 胃癌組織中銅含量較高，與腫瘤進(jìn)展有關(guān)^[3]。
a.胃癌組織中銅的濃度(綠點(diǎn))(n=48)明顯高于鄰近正常組織(橙點(diǎn))(n=48)，(紫色字體為銅濃度均值，P<0.01)。
b. III期胃癌患者的相對(duì)銅含量高于I期和II期胃癌患者(P<0.05)。

銅離子檢測(cè)試劑盒操作步驟

一、試劑盒組分

二、操作步驟：

1、材料和試劑：

自備材料：酶標(biāo)儀、蒸餾水、移液器與槍頭、離心機(jī)、計(jì)時(shí)器、濕冰等。

標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水連續(xù)兩倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

Masking Reagent：使用1mL蒸餾水溶解（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

Dye Reagent：使用1mL Dye Reagent Diluent溶解Dye Reagent，70℃加熱助溶（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2、樣本處理：

a. 組織樣本：稱取1g組織，加入1mL Assay buffer在濕冰上勻漿，4℃，10000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，濕冰上保存待檢測(cè)。
b. 細(xì)胞/細(xì)菌樣本：將細(xì)胞/細(xì)菌（5×10⁶）收集到離心管中，離心后去掉上清液，加入1mL Assay buffer，超聲處理（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）后于4℃，10000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，濕冰上保存待檢測(cè)。
c. 液體樣本：直接檢測(cè)。

3、上樣：分別將140uL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品加入相應(yīng)孔中，另設(shè)置空白孔加入140uL蒸餾水；每孔分別再加入40uL Reaction Buffer，10uL Masking Reagent以及10uL Dye Reagent，混合均勻，室溫孵育15min。

4、檢測(cè)：使用酶標(biāo)儀測(cè)定605nm處的吸光度，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣本濃度。

常見問題解答

Q1：該試劑盒檢測(cè)組織樣本，對(duì)組織樣本的處理有要求嗎？

A1：金屬螯合劑（如EDTA）會(huì)干擾此分析，在樣品制備中應(yīng)避免使用。

Q2：該試劑盒檢測(cè)的是Cu⁺還是Cu2⁺還是總銅？

A2：試劑盒檢測(cè)的是總銅。

Q3：樣品的稀釋倍數(shù)有推薦嗎？

A3：對(duì)于未知的樣品，我們建議多做幾個(gè)稀釋梯度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定合適的稀釋倍數(shù)。

Q4：試劑盒操作說明書中既有標(biāo)準(zhǔn)曲線法又有公式法，我應(yīng)該選擇哪種計(jì)算方式？

A4：兩種方式任選一種就可以，公式是簡(jiǎn)便算法，建議按照標(biāo)曲計(jì)算，會(huì)更加準(zhǔn)確。需要注意的是，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，每次實(shí)驗(yàn)必須重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Q5：試劑盒中的Dye Reagent稀釋溶解后應(yīng)該如何保存？

A5：染料(Dye)現(xiàn)配現(xiàn)用，溶解后易氧化變質(zhì)，建議分裝后4℃，避光保存。

[1] 史曉群, 杜希友.銅死亡機(jī)制及相關(guān)抗癌藥物[J].生命的化學(xué), 2024, 44(2): 225-232.
[2] Xie J, Yang Y, Gao Y, et al. Cuproptosis: mechanisms andlinks with cancers[J]. Mol Cancer, 2023, 22(1): 46.
[3] Sun L, Zhang Y, Yang B, et al. Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer[J]. Nature Communications, 2023, 14(1).

生化檢測(cè)試劑盒推薦：

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