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                微生物平板計數法和流式檢測法介紹

                更新時間:2024-03-08      點擊次數:784

                食品安全的重要性不言而喻,而微生物檢測是食品安全檢驗的重要組成部分。在進行微生物檢測時,首先要根據其性質和特點,選擇適合的微生物檢驗方法,同時還要明確食品的污染狀況、危害程度以及具體的檢驗項目和要求。

                 

                微生物檢測方法包括常規檢測法(如平板計數法、涂片鏡檢、分離培養、生化試驗、血清學試驗等)、免疫學方法、分子生物學方法、代謝學技術等。本期小愛向大家介紹2種常用的微生物檢測方法:平板計數法和流式檢測法。

                 

                1、平板計數法

                 

                微生物平板計數常用3種培養基:牛肉膏蛋白胨培養基、高氏 (Gause)Ⅰ號培養基Martin瓊脂培養基。針對食品微生物檢測常用培養基的配制,應當根據不同檢驗目的,選擇不同的配制材料,常見的培養基材料配比如表1。在實際食品微生物檢驗過程中,根據不同的需要對配制材料進行選擇。

                 

                牛肉膏蛋白胨培養基:主要用于食品微生物中細菌的培養。為保證培養基的質量,需要在125℃環境下持續進行15min的滅菌處理。

                 

                高氏 (Gause)號培養基主要用于放線菌的培養。在配制的過程中,首先應當在淀粉中添加少量的冷水,通過攪拌得到糊狀淀粉后,再將其倒入100℃的水中,然后加熱并加入其余配制材料攪拌至溶化。配制后同樣需要在125℃環境下持續進行15min的滅菌處理。

                 

                Martin瓊脂培養基主要用于微生物中真菌的分離,完成滅菌處理后,在使用前加入0.02%鏈霉素稀釋液,通常為100~150mL,保證每毫升培養基當中均含有25μg鏈霉素。

                 

                表1  73種常用培養基材料配比[1]


                培養基名稱

                配制材料

                牛肉膏蛋白胨培養基

                牛肉膏(3.5g)、蛋白胨(5.5g)、氯化鈉(11g)、瓜爾豆膠(13~21g)、PH(7.0~7.3)、水(1500mL)

                高氏 (Gause) Ⅰ號培養基

                可溶性淀粉(15g)、硝酸鉀(1.5g)、磷酸氫二鉀(0.25g)、硫酸鎂(0.25g)、瓊脂粉(15g)、磷酸氫二鉀(0.25g)、硫酸鎂(0.25g)、PH(7.0~7.3)、水(1500mL)

                Martin瓊脂培養基

                葡萄糖(11.5g)、蛋白胨(4.5g)、磷酸二氫鉀(0.85g)、七水合硫酸鎂(0.25g)、1/2000孟加拉紅(120mL)、瓜爾膠(11~25g)、PH(自然)、蒸餾水(750mL)




                 

                然而,平板計數法時效性不足、難以區分死活、無法檢測非培養性微生物。微生物活的非可培養 (Viable but non-culturable,VBNC) 狀態(圖1)給平板計數法帶來了挑戰,同時也吸引了越來越多學者的關注。流式細胞術可解決平板計數法檢測不到VBNC狀態菌的問題。

                 

                圖1 VBNC狀態的形成與復蘇

                 

                2 、流式檢測法

                 

                微生物的流式細胞儀檢測也是科學研究中比較常用的檢測技術。與真核生物細胞相比,細菌等微生物的體積較小,其散射光難以與其他物質的顆粒區分。因此,通過流式細胞儀的檢測依賴于與細胞結合的熒光染料,用于從背景中識別真正的目標物。

                 

                A:液流系統;B:光源系統;C:檢測和計算、分析系統

                圖2 流式細胞儀的組成及工作原理[2]

                 

                根據熒光底物的不同,適用于流式檢測法的熒光染料主要包括:結合核酸的染料,如PI、7-AAD;標記抗體蛋白的染料,如Cy5、FITC、PE。不同的熒光染料具有不同的激發波長和發射波長。流式細胞儀通常會配備多個激光器,如405nm、488nm、633nm 等。多激光器可實現多熒光通道分析,減少自發熒光干擾、減少熒光信號之間的補償,提高檢測靈敏度。

                 

                表2 微生物流式檢測常用染料


                染料名稱

                被標記物

                標記特點

                激光器

                PI

                DNA

                與DNA結合,幾乎無序列偏好。不能透過活細胞的細胞膜,用于群體中死細胞檢測

                488nm氬離子激光器

                7-AAD

                DNA

                可用于替代PI,在與PE或FITC的雙色分析中減少波長之間的光譜重疊

                488nm氬離子激光器

                Cy5

                DNA、蛋白

                常用于標記寡核苷酸、蛋白抗體

                633nm氦氖激光器

                FITC

                蛋白

                應用廣泛的熒光素類標記,標記蛋白抗體

                488nm氬離子激光器

                PE

                蛋白

                標記蛋白抗體,與FITC同染時需要扣除熒光補償

                488nm氬離子激光器




                 

                另外,流式細胞術熒光標記的選擇還需考慮儀器配置的光源波長、染料的亮度與靶標表達量的匹配、染料光譜重疊和樣本自發熒光等多重因素。

                 

                3、7-AAD流式檢測原理及方法

                 

                7-AAD是一種核酸染料,它在細胞凋亡和細胞死亡過程中會被釋放出來。當細胞開始凋亡時,其質膜對7-AAD的通透性會逐漸增加。在特定的波長激發下,7-AAD可以發出明亮的紅色熒光。通過這種熒光的強度,可以將細胞分為三個群體:7-AAD信號強的代表死亡細胞,7-AAD信號弱的則是處于凋亡狀態的細胞,而沒有檢測到7-AAD信號的是正?;盍Φ募毎?。

                 

                該操作步驟適用于大多數細胞,但不同的細胞類型、細胞密度、使用的培養基以及其他一些因素都有可能影響染色效果以下步驟僅供參考。

                 

                1)儲存液的制備:取適量DMSO加入到7-AAD原瓶中配制成1-10mM儲存液,分裝保存于-20℃,可穩定保存6個月;
                2)根據自身樣本選擇合適的步驟固定細胞。7-AAD染色一般在其它染色完成后再進行,且僅僅染色死細胞;
                3)離心收集細胞,并用合適的的緩沖鹽溶液或者培養基(pH=7.4)重懸細胞;
                注:貼壁細胞可在蓋玻片或者培養板上進行原位染色。
                4)加入適量7-AAD染色液,推薦該染料的工作濃度為0.5-5µM,孵育15-60min;
                注:實驗建議在推薦的工作濃度范圍內設置濃度梯度檢測,從而摸索最佳的染色濃度。
                5)根據其最大激發和發射波長(Ex/Em=545nm/650nm)在流式細胞儀下(FL3通道)檢測熒光強度。

                 

                圖3 用0.25μg/106 cells 7-AAD復染,流式檢測計算細胞死亡率[3]

                 


                參考文獻


                [1] 吳芳媛,馮秋芳,林黎.食品微生物檢驗常用培養基配制,滅菌及貯藏研究[J].食品安全導刊, 2020(36):1.
                [2] 高惠敏,顏春榮,徐春祥,等.食品微生物檢驗中流式細胞術的研究進展[J].生物災害科學, 2023, 46(4): 549-556.
                [3] Tian X X, Nanding K, Dai X Y, et al. Pattern recognition receptor mediated innate immune response requires a Rif-dependent pathway[J]. Journal of Autoimmunity, 134 (2023) 102975.  影響因子:14.511

                 

                微生物培養基原料:


                貨號

                品名

                規格

                abs42219719

                瓊脂粉

                500g

                abs44077794

                酵母浸粉

                250g

                abs47014867

                胰蛋白胨

                500g

                abs47047439

                酸水解酪蛋白

                1Kg

                abs47048257

                胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)

                250g

                abs47048258

                營養肉湯(NB)培養基

                250g

                abs47048259

                牛肉浸粉

                250g

                abs47048260

                牛肉浸膏

                500g

                abs47048261

                肉湯培養基粉劑(CM)

                1L

                abs47048279

                LB肉湯(Lennox)

                250g

                abs47048280

                LB肉湯(Miller)

                250g

                abs47048281

                LB營養瓊脂(Miller)

                250g




                 

                流式檢測常用染料:


                貨號

                品名

                規格

                λEx(nm)/ λEm(nm)

                abs42018594

                5-FITC

                500mg

                494/520

                abs45153587

                B-PE (B-Phycoerythrin)

                1mg

                545/578

                abs47038465

                Sulfo-Cy5-E

                1mg

                646/661

                abs9104

                7-AAD

                1mg

                545/650

                abs9358

                PI

                10mL

                535/617




                 

                流式檢測常用串聯染料:


                貨號

                產品名稱

                規格

                λEx(nm)/λEm(nm)

                 abs47048236

                串聯染料APC-Cy7

                1mg

                651/780

                 abs47048237

                串聯染料PerCP-Cy5.5

                1mg

                489/679

                abs47048238

                串聯染料PE-Cy5

                1mg

                565/670

                abs47048239

                串聯染料APC-Cy5.5

                1mg

                651/700

                abs47048240

                串聯染料PE-Cy7

                1mg

                565/780

                abs47048241

                串聯染料PE-Cy5.5

                1mg

                565/700




                 

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