類器官傳代技巧——具體情況具體分析

概述：

類器官傳代是一個痛點，經常出現傳代后類器官丟失，類器官不長也不死，類器官凋亡。究其原因，主要是兩大類，一類是類器官消化過度，一類是基質膠殘留太多，和類器官難以分離，導致丟失嚴重。今天給大家分享類器官在傳代過程中需要注意關鍵事項！

實驗步驟：

不同類器官的培養難易程度不同，所以傳代時要根據類器官培養狀態具體情況具體分析，大致分為兩種情況，第一種情況是類器官數量不足或體積較小時，不建議消化，我們可以來看一組類器官圖片。

圖1 類器官數量不足或體積較小圖

一、類器官數量不足或體積較小時：

1、類器官收集及洗滌

1）移液器吸去培養基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液(abs9730)，輕柔吹散基質膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）；

2）進行吹打，將類器官吹成細胞團（可取樣置于顯微鏡下觀察是否吹打成細胞團）；

3）加類器官傳代培養緩沖液(abs9730)定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱冷凍效果強，冷凍3min），300g，4℃， 離心5min棄上清，進行第三步。注：如基質膠去除不理想，此步驟可再重復1-2次。

圖2 囊泡型類器官吹打傳代后圖片

圖3 致密型類器官吹打傳代后圖片

2、類器官鋪板

對于類器官較少的情況，需要3-5孔富集到1孔，例如24孔板收集6孔，傳代2孔，需要的基質膠量25*2=50uL，每孔25μL基質膠鋪細胞團混懸物在24孔細胞培養板中，放置培養箱中40-60min，添加500μL-750uL類器官培養基。

第二種情況是類器官數量較多或體積較大時，建議消化，我們可以來看一組類器官圖片。

圖4 類器官數量較多或體積較大圖片

二、類器官數量較多或體積較大時：

1、類器官收集及洗滌

1）移液器吸去培養基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液(abs9730)，輕柔吹散基質膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）（如圖所示）。

2）加類器官傳代培養緩沖液定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱冷凍效果強，冷凍3min），300g，4℃，離心5min棄上清。

圖

2、類器官消化

1）添加適量類器官傳代消化液(abs9520)（是類器官懸液的1-2倍）超凈臺內消化2-3min（中間可以吹打1-2次）（如圖7） ；

2）添加適量類器官傳代培養緩沖液（緩沖液G：傳代消化液D=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清；注：此步驟如果殘留膠過多（大于50uL），可重復類器官收集及洗滌的第2步1-2遍（如圖8、9）；

3）添加1mL類器官傳代培養緩沖液重懸移入5mL（如圖10）離心管，300g，4℃離心5min，棄上清。

三、類器官鋪板

類器官通常按1:2傳代，例如24孔板收集5孔，傳代10孔，需要的基質膠量25*10=250uL，每孔25μL（如圖11）基質膠鋪細胞團混懸物在24孔細胞培養板中，放置培養箱中40-60min，添加500μL-750uL（如圖12）類器官培養基。

消化傳代后的類器官如下圖所示

圖 ICC經消化傳代后的鋪板圖

四、類器官傳代后增殖現象

常見問題：

1、收集的基質膠類器官離心后正常分成幾層？

答：正常離心后會分成3層（如下圖）：緩沖液、基質膠、類器官沉淀，留類器官沉淀即可。

2、收集的基質膠與類器官離心后不分層是什么原因？

答：因素很多，例如類器官數量量少，體積小，降溫時間不夠，基質膠粘稠等因素，離心后往往兩層（如下圖）。如果反復清洗離心，基質膠和類器官仍未分離，可保留基質膠類器官混懸物下2/3傳代。（上1/3基本是原代細胞雜質或死細胞）

3、如何有效地分離基質和類器官？可從以下幾點著手：

1、加盡可能多的緩沖液（例如15mL離心管，緩沖液加到14mL），稀釋基質膠類器官混合物，能促進分離；

2、將基質膠類器官混合物放于-20℃，5min（注意：如果冰箱冷凍效果強，冷凍3min），加速基質膠液化，能促進分離；

3、離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；

4、離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

今天講解就到這了，大家如有類器官問題，歡迎公眾號后臺“愛必信生物"留言哦！

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