國自然研究熱點“常青樹”—外泌體&miRNAⅢ

背景：

外泌體是細胞分泌的一類具有細胞間通訊作用的細胞外囊泡，已被證明外泌體中包含了大量的脂質、蛋白質、酶、核酸等生物活性物質。其中的微小RNA (microRNA，miRNA) 是外泌體中比較具代表性的，也是目前研究最多的核酸。miRNA是18-25個核苷酸的非編碼小RNA分子，它可以通過與靶mRNA的3’非翻譯區或開放閱讀框區域結合而介導轉錄后基因沉默，在細胞增殖、分化、遷移及疾病發生和發展等過程中發揮重要調控作用。

miRNA的生成：

miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄生成長度約為幾千個堿基的初級miRNA (pri-miRNA) 。pri-miRNA在蛋白復合物Drosha-DGCR8的作用下被加工成具有莖環結構的前體miRNA (pre-miRNA) ，pre-miRNA在轉運蛋白的協助下從核內轉運到細胞質中。在細胞質中，pre-miRNA被Dicer-TRBP識別，并通過對莖環結構的剪切和修飾，形成雙鏈成熟的miRNA，但其中一條鏈迅速降解，另一條鏈被轉載進AGO2蛋白中，形成RISC（RNA誘導沉默復合體），最終生成成熟的、具有功能單鏈miRNA。

單鏈miRNA與靶miRNA轉錄物相互作用，從而導致基因表達的抑制。

圖 外泌體miRNA分泌機制

miRNA的特性：

1、高度保守性：miRNA保守性具有重要的生物學意義，提示在不同生物發育過程中，miRNAs具有相同的調控機制；

2、組織表達特異性：一些miRNA表達具有細胞和組織特異性；

3、時序表達特異性性：在不同組織、不同發育階段，miRNA的表達水平有顯著差異，miRNA表達是動態調控的。

miRNA的功能：

目前只有一小部分miRNAs生物學功能得到闡明。但這些miRNAs調節了細胞生長，組織分化，因而與生命過程中發育、疾病有關。通過對基因組上miRNA的位點分析，顯示其在發育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明：miRNAs在細胞生長和凋亡，血細胞分化，神經元的極性，胰島素分泌，大腦形態形成，心臟發生，胚胎后期發育等過程中發揮重要作用。對于新的miRNA基因的分析，可能發現新的參與器官形成、胚胎發育和生長的調節因子，促進對癌癥等人類疾病發病機制的理解。

miRNA檢測方法：

考慮到miRNAs在基因調控和生物學功能中起到的關鍵作用，對miRNAs的特異性和敏感性檢測變得越來越重要。傳統的針對miRNA的檢測有Northern blotting、微陣列分析和定量聚合酶鏈反應 (qPCR) 。

1、Northern blotting

Northern blotting是檢測miRNA的標準和比較廣泛使用的方法。它不僅可以用于成熟miRNA的檢測，還可以用于其前體的檢測。其基本原理是將RNA樣品用限制性內切酶酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，根據其在凝膠中的位置變性并轉移到硝化纖維素膜或尼龍膜上，固定后與同位素或其他標記探針反應。洗凈游離探針后，可以通過放射自顯影或其他合適的技術檢測miRNA。Northern blotting可以檢測到miRNA的相對分子大小和相對豐度，但也存在半定量、低通量、繁瑣、耗時、RNA易降解等缺點。

2、微陣列分析

微陣列分析是快速、高通量檢測miRNA比較廣泛使用的方法。該方法原理是使用標記探針通過反轉錄產生樣品RNA，使用與目標miRNA具有相同序列的固相寡核苷酸檢測這些熒光團或生物素標記的cDNA。將標記的cDNA樣品裝入每個孔中，然后進行一系列洗滌步驟以去除游離DNA。如果雜交的cDNA被生物素化，鏈霉親和素標記的熒光團就可以被標記;如果用熒光團標記cDNA，則可以直接測量每個孔的熒光強度。每個孔的熒光強度可以用來確定miRNA的表達水平。雖然微列陣芯片針對的樣本數量很多，但是成本也非常高。另外太短、低拷貝數的miRNA無法被檢測到。

3、qPCR

qPCR因其動態范圍大、靈敏度高、序列特異性高，已成為檢測miRNA表達的常規可靠技術。首先通過逆轉錄反應將目標miRNA合成為cDNA，然后進行qPCR檢測。要進行miRNA逆轉錄，需要對miRNA分子進行加長改造，一種方法采取的是進行Poly (A) 加尾，另一種采取的莖環法進行加長。監測miRNA的qPCR方法有兩種：TaqMan探針法和SYBR Green熒光染料法。

miRNA定量全套實驗步驟：

圖 miRNA qPCR解決方案

從各類樣本中提取miRNA，根據miRNA數量選擇不同逆轉錄方法合成cDNA（如何選擇miRNA逆轉錄方法見），最后進行miRNA定量。我們推薦從miRNA提取到逆轉錄、定量需要要配套的試劑盒。

一、miRNA提取

* 以血清血漿樣本為例進行介紹（血漿血清miRNA提取試劑盒，abs60264）

1、實驗前處理；

1.1 實驗前自行準備：無水乙醇、1.5mL RNase-free滅菌離心管。
1.2 取出洗滌液，按以下操作：
a）洗滌液A：按終濃度30%的比例加入無水乙醇，如7mL加入3mL無水乙醇；14mL加入6mL無水乙醇，充分混勻。
b）洗滌液B：按終濃度85%的比例加入無水乙醇，如1.5mL加入8.5mL無水乙醇；3mL加入17mL無水乙醇，充分混勻。
* 配制好的洗滌液如出現沉淀，可在37℃溶解，搖勻后使用。

2、取無RNA酶的1.5mL離心管，加入200μL樣本，200μL miRNA釋放劑及20μL消化液，充分混勻，65℃水浴10min；
3、加入5μL miRNA富集劑，0.85mL無水乙醇，輕輕顛倒混勻，如有半透明懸浮物，不影響RNA的提取與后續實驗；
4、將吸附柱放入收集管內，將650μL上述溶液轉入吸附柱內，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液；將剩余溶液轉移至吸附柱內，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液；
5、將吸附柱放回收集管內，加500μL洗滌液A至吸附柱內，靜置2min，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液；
6、將吸附柱放回收集管內，加500μL洗滌液B至吸附柱內，靜置2min，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液；
7、將吸附柱放回收集管內，加500μL洗滌液B至吸附柱內，12000rpm離心1min，棄收集管內廢液；
8、按每份樣本30μL取洗脫液（如10份提取樣本，即取300μL洗脫液），放置于滅菌1.5mL離心管，65℃預熱；
9、將吸附柱放回收集管內，12000rpm離心2min，離去殘留的洗滌液；
10、取出吸附柱，放入新的1.5mL RNase-free滅菌離心管內，開蓋，室溫放置2min；
11、在吸附柱中心加入30μL預熱洗脫液，靜置2min，12000rpm離心1min，收集miRNA溶液。提取的miRNA即可用于下一步實驗或-70℃保存。

二、miRNA逆轉錄

* 以加尾法為例進行實驗步驟介紹，血漿miRNA加尾法逆轉錄試劑盒（abs60266）

1、RNA加A尾

 取RNase-free離心管，配制如下混合液：RNase free ddH₂O to 20μL 、Poly A 1μL、2xPoly A Buffer 10μL、RNA 5~9μL輕輕混勻，37℃ 30min，迅速置于冰上。

2、RT反應液配制：

上述反應液在使用前5000rpm離心5s：取上述反應液8μL、2x RT Buffer 10μL、 RTase Mix 2μL用移液器輕輕吹打混勻。

3、RT反應：

25℃ 5min、50℃ 15min、85℃ 5min反應完畢后，5000rpm離心5s，盡快放于冰上，直接進行PCR反應。如暫時不用，請放置于-20°C以下溫度，在半年內使用完畢，不要反復凍融。模板如具有復雜二級結構或高GC區域，可將反應溫度提高至55℃。

三、miRNA qPCR

* 逆轉錄選擇加尾法，qPCR反應選擇配套的加尾法qPCR試劑盒，miRNA加尾染料法熒光定量PCR試劑盒（abs60271）

1、配制反應體系

取RNase-free離心管，配制如下混合液：

* a）Specific Primer指miRNA的上游特異性引物，即由本公司設計的正向引物，一般標注為：xx-miR-X-X-F，該引物可自行設計合成，本公司也可免費提供設計；若使用U6作為參照時，Specific Primer標注為U6-Forward Primer。

* b）Tag Primer為本公司專用miRNA反向引物，若使用U6作為參照時，Tag Primer標注為 U6-Reverse Primer。

2、設置反應程序

* 儀器類型不同，熔解曲線采集程序不同，使用儀器默認熔解曲線采集程序即可。

3、檢測及結果分析

在適當的qPCR儀器上完成實驗，并分析結果。

FAQ：

1、miRNA逆轉錄&qPCR方法有哪些？

加尾法（常用，一次可以檢測多種miRNA，非常加方便）；

莖環法（常用，一次只能檢測一種miRNA，但是特異性高）；

探針法（較上面二種方法用的會相對少一些，特異性、靈敏度最高）。

2、miRNA逆轉錄加尾法與莖環法的具體區別？

1）加尾法：

對所有的miRNA都進行polyA加尾，選用通用的逆轉錄引物，把所有的miRNA都進行逆轉錄，逆轉錄的產物可以分別用于各個miRNA的qPCR的反應。一般如果檢測的miRNA數量比較多的話，比較推薦加尾法做，因為一次性可以逆轉錄很多miRNA。（例如要檢測5種miRNA，就選加尾法，買一套試劑盒就能同時測5種）

2）莖環法：

對每個miRNA進行單獨逆轉錄，每個miRNA都要有特異的逆轉錄引物，同時qPCR引物也是特異的，所以它的特異性比加尾法高，但是一次只能測一種miRNA。當miRNA數量不多，選莖環會比較好。（例如要檢測1-2種miRNA，并且追求特異性，就選莖環法。）

3、miRNA逆轉錄和miRNA q-PCR一定要配套使用嗎？

是的，因為逆轉錄試劑盒和q-PCR試劑盒里面有成分相互關聯，不能分開使用，所以買逆轉錄就一定要買對應qPCR試劑，并且我們還免費設計引物。

miRNA莖環法逆轉錄配miRNA莖環法qPCR；

miRNA加尾法逆轉錄配miRNA加尾法qPCR；

miRNA探針法逆轉錄配miRNA探針法qPCR。

4、哪種miRNA逆轉錄&qpCR選擇哪種方法價格便宜呢？

選擇加尾法還是莖環法，具體是看具體實驗需求，不能以價格來選擇；

加尾法：一套試劑盒價格雖然貴些，但它一次能測多種miRNA，所以樣本量多的情況下價格又便宜了；

莖環法：一套價格便宜，但是一次只能測一種，如果再測第二種第三種，又要重新設計引物，買試劑盒，總價格就高了。

5、miRNA引物怎么送？

免費設計1個miRNA引物，比如需要5個miRNA的引物，那么可以送其中一種，其余4種不送，需要定制合成購買，需要按照要求發送引物的目的基因。

6、關于miRNA引物合成，需要給什么信息？

需要發送引物的目的基因，也就是miRNA名字、ID號、序列，其中miRNA的名字和序列最重要，目的基因需要客戶自己去查詢確定；

一般引物信息格式如下：hsa-miR-22-3p AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU。

7、引物哪些在試劑盒里，哪些不在試劑盒中？U6分別是幾條？

加尾法一套:

miRNA加尾法逆轉錄（逆轉錄引物，通用的，在試劑盒里面）；

miRNA加尾法qPCR（送上游引物，是特異性引物，要單獨設計，不在試劑盒里面；下游引物，是通用引物，在試劑盒里面）；

U6內參：2條（不送，不在試劑盒里面，需要客戶自己準備）；

定量U6-F（指U6上游）；定量U6-R（指U6下游）。

莖環法一套:

miRNA莖環法逆轉錄（送莖環引物，是特異性引物，要單獨設計，不在試劑盒里面）；

miRNA莖環法qPCR（送上游引物送，是特異性引物，要單獨設計，不在試劑盒里面；送下游引物，是通用引物，在試劑盒里面）；

U6內參：3條（不送，不在試劑盒里面，要客戶自己準備。因為莖環法是特異的，所以它的U6也是要單獨設計一套）；

U6-NZL（指U6的逆轉錄）；U6-F（指U6的上游）；U6-R（指U6的下游）。

探針法一套:

探針法逆轉錄（逆轉錄引物混在Taqman buffer里）;

探針法qPCR（上游+下游+探針，混在primer mix里，不是獨立的管子）;

U6內參（不送，U6上游+U6下游+探針，混合在一個管子，需要客戶自行購買）。

8、U6內參是什么？

內參是在各類細胞中普遍存在的一個基因，用于排除由于加樣量差異導致的誤差。做miRNA逆轉錄和qPCR實驗過程中是需要內參的，客戶一般會選擇合適的基因作為內參，不一定非要選擇U6。但一般都是以U6內參為主，它是比較常用的。

9、可以發送試劑盒引物序列嗎？

miRNA引物的序列公司這邊是保密的。如果客戶需要發表文章必須要用到的情況下可以提供，但是前提是需要客戶在文獻里寫明：設計與合成來自愛必信（上海）生物科技有限公司，并附上產品貨號。

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