國自然研究熱點“常青樹”—外泌體介紹II

背景介紹：

自從2013年榮獲諾貝爾獎后，外泌體就一直是國際科研界的研究熱點。近十年來，它的熱度一直居高不下，如今依然穩坐在國自然熱點排行榜的第五名！讓我們繼續揭開這個細胞外囊泡的神秘面紗！

外泌體個人名片：

姓   名：外泌體 (Exosome) ；

種   屬：細胞外囊泡；

大   小：直徑30-150nm；

密   度：1.1-1.18g/mL；

形   狀：呈“茶托狀"；

來   源：由所有活細胞分泌；

存   在：幾乎存在于所有的組織、細胞間隙、體液中；

數   量：人體中大約有10¹⁴個，近乎于平均每個細胞產生1000-10000個；

功   能：調節細胞代謝、控制炎癥、促進血管新生、促進組織修復、免疫調節、癌癥的發生發展、抗原呈遞等；

榮   譽：獲得2013年諾貝爾生理學或醫學獎。

攜帶物質：脂質、蛋白質、DNA和RNA (miRNA、lncRNA、circular RNA、mRNA) ；

突出特性：異質性，即同一種細胞分泌的外泌體都有可能具有很大的功能區別；

圖 外泌體結構與特征

外泌體的特性及相關應用：

1、異質性，可作為生物標記物，用于疾病診斷

不同細胞分泌的外泌體在數量、細胞膜與內容物成分、生物學功能都有所不同，具有異質性；外泌體的大小和含量可反映分泌細胞的類型和狀態，并能精準調控機體內的各種生理活動，可作為生物標志物用于疾病診斷。通過分離、提純體液中的外泌體，分析其內含的特征miRNA或蛋白質等，再通過與疾病特征標志物進行比對就能判斷疾病類型。

2、呈遞性，可用于免疫調控

外泌體一般通過傳遞多種生物分子完成抗原呈遞、免疫活化抑制及免疫耐受過程。其中，抗原呈遞細胞分泌的外泌體能攜帶并呈遞相關復合物，通過減弱或增強免疫反應達到免疫治療的目的。此外，外泌體還裝載著諸多免疫相關分子，包括溶酶體相關膜蛋白1和2、免疫球蛋白超家族成員8及MHC ，可特異性結合相關肽鏈、誘導免疫應答。

3、脫免性，可作為藥物遞送載體

外泌體具有免疫原性低特點，可逃逸大部分免疫系統的識別和攻擊。相較于傳統化學藥物的生物相容性差、易被人體清除、溶解度及滲透性差等缺點，外泌體具有諸多優勢如：納米尺度的體積、低細胞毒性、良好的生物膜透膜性和生物相容性，且其脂質雙層膜結構可保護內容物不被降解，維持生物活性。因此，外泌體可作為載體遞送藥物，幫助藥物逃逸免疫系統、跨越組織屏障，提高藥物遞送和吸收效率。

4、促瘤性，可應用于腫瘤治療

腫瘤細胞來源外泌體的促瘤性表現為在調節機體免疫功能的同時，也會向受體細胞傳遞有害信息，導致細胞病變；并且，腫瘤細胞還會通過分泌外泌體將一部分藥物排出細胞或與功能性藥物抗體結合，降低藥效、產生耐藥性。諸多研究表明，晚期腫瘤細胞分泌的外泌體可抑制抗腫瘤的免疫應答，促進腫瘤的生長與擴散。近年來，外泌體在腫瘤治療應用方面產生了諸多新的干預措施，如阻止外泌體的生成、分泌和阻斷外泌體介導的細胞通信。

5、誘導性，可應用于再生醫學

外泌體還具有誘導細胞分裂和分化的功能，可促進間充質干細胞 (MSCs) 分化為不同細胞以替代受損的組織細胞，應用于再生醫學領域。如從人臍帶間充質干細胞的條件培養液中提取的外泌體可促進細胞的增殖及遷移，抑制線粒體凋亡信號通路，從而促進皮膚創面的修復。許多公司已研發出基于外泌體的再生醫學產品，涵蓋傷口再生、藥妝產品、美容等領域。

外泌體研究整體方案：

圖 外泌體整體研究方案流程圖

外泌體鑒定：

在上一期——《國自然研究熱點“常青樹"—外泌體介紹Ⅰ》文章中，給大家詳細介紹了外泌體提取純化的各類方法。外泌體分離純化之后，需要進行表征鑒定，以判斷純化效果，并評估獲得的外泌體是否滿足下游實驗的需求。對外泌體進行表征鑒定的方法很多，分析的指標也是多方面的，其中大小、形態、表面標志物這三個方面的檢測是最重要的，這也是國際細胞外囊泡學會 (ISEV) 建議對分離獲得的外泌體必須進行的表征鑒定方法。

1、外泌大小/形態鑒定—電子顯微鏡

掃描電鏡 (SEM) 或透射電鏡 (TEM) 等電子顯微鏡可以直觀的看到粒子的形態，因此可以用于鑒定外泌體的存在和完整性。操作步驟大致是：用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2nm的載樣銅網上，室溫靜置2min，用濾紙從濾網側邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負染5min，濾紙吸干負染液，室溫晾干，電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~150nm大小不一的茶托或杯狀結構（也會有200nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體）。

圖 電子顯微鏡檢測外泌體形態

注：圖片來源于網絡，如有侵權請聯系刪除。

2、外泌體粒徑/濃度檢測—納米顆粒示蹤分析 (NTA)

NTA技術可檢測外泌體的粒徑和數量，其操作步驟是：將收集的外泌體用PBS稀釋至10⁶ 個/mL，用1mL注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀；激光光束穿過樣本室外泌體顆粒，通過裝有攝像頭的顯微鏡實現顆粒可視化，捕捉外泌體的布朗運動，最后利用方程式根據其運動計算濃度和流體力學直徑。相較于其他外泌體鑒定方式，NTA技術的樣本處理更簡單，更能保證外泌體原始狀態，檢測速度更快。

圖 NTA檢測外泌體粒徑/濃度

3、外泌體表面標志物鑒定—WB檢測

對外泌體生化方面的分析鑒定主要是對其所攜帶的特異性蛋白標記物的檢測，WB檢測是一種常見的外泌體特定蛋白（如四跨膜蛋白、腫瘤易感基因101蛋白﹑脂筏標記蛋白、凋亡誘導因子6相互作用蛋白等）分析技術。具體操作參考標準WB操作，利用外泌體特異性蛋白的抗體進行標記，從而對外泌體進行定性檢測分析。

圖 WB檢測外泌體標志性蛋白

還有其他方法可以用于鑒定外泌體，如ELISA、流式細胞術及質譜也常用于檢測外泌體的數量及表面標志蛋白如CD9、CD63、CD81的表達。

外泌體定量檢測試劑盒介紹：

愛必信ELISA夾心法檢測外泌體含量試劑盒(abs50054)，利用高性能抗CD9捕獲和抗CD81檢測抗體，可用于檢測人體體液或細胞培養上清液，靈敏和定量地檢測共表達外泌體表面標記CD9和CD81的靶標，實現樣本中完整外泌體的快速精準定量。

圖 外泌體定量檢測試劑盒原理

產品組分：

實驗步驟：

1、試劑配制

1）所有試劑應在使用前室溫平衡至少15min；

2）取濃縮洗液，用蒸餾水或去離子水將20X濃縮洗液稀釋成1X工作液，混勻備用；

3）顯色底物液在檢測前A和B按1:1混勻使用。

2、實驗過程

1）準備板條，試劑充分搖勻；

2）用移液槍分別取100μL標準品SO-S5，待測樣品分別加入微孔板；

3）用封板膜封好板孔，37℃，60min；

4）工作液洗液清洗3次，每次300-350μL/孔，在吸水紙上拍干板孔中殘留液體；

5）每孔加入100μL酶結合物；

6）用封板膜封好板孔，37℃，60min；

7）工作液洗3次，每孔300-350μL/孔，在吸水紙拍干；

8）向反應孔加入100μL顯色底物液工作液，37℃避光反應30min，加入50μL終止液，酶標儀450nm下讀數，并繪制XY線性曲線。

3、校準程序

XY線性擬合，其線性相關系數R2≥0.99，每次實驗都要做全套校準品，繪制曲線。

參考文獻：

[1] 史玉瀟,蘆曉紅,盧望丁等.外泌體的生物學性質及應用概述[J].中國醫藥工業雜志,2023,54(07):1008-1019.DOI:10.16522/j. c nki.cjph.2023.07.004.

[2] Wu Y, Deng W, Klinke DJ 2nd. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 2015 Oct 7;140(19):6631-42. doi: 10.1039/c5an00688k. PMID: 26332016; PMCID: PMC4986832.

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[4] 南德. 脂肪干細胞外泌體的分離鑒定及遞送姜黃素的體外抗肝癌研究[D].大連理工大學,2021.DOI:10.26991/d. c nki.gdllu.2020.001248.
 

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