國自然研究熱點(diǎn)“常青樹”| 外泌體介紹Ⅰ

背景介紹：

剛發(fā)現(xiàn)外泌體時(shí)，這種比多泡體還要小的細(xì)胞外囊泡被視為細(xì)胞外排出的代謝垃圾，但隨著對這種細(xì)胞外囊泡不斷地深入研究，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞外囊泡在細(xì)胞之間的通訊交流中發(fā)揮著極其重要的作用。

外泌體是什么？

外泌體是機(jī)體所有活細(xì)胞分泌的一種直徑約為30-150nm的細(xì)胞外囊泡，廣泛存在于各種生物體液（血液、尿液、母乳、唾液、胸水、腹水、腦脊液等）中。它們由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸的特定成分組成，可以將信號傳遞給受體細(xì)胞，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊。外泌體在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用，包括參與RNA、蛋白質(zhì)、酶和脂質(zhì)等生物分子的轉(zhuǎn)移，以及各種生理和病理過程的調(diào)節(jié)。

外泌體屬于細(xì)胞外囊泡的一種，根據(jù)直徑大小以及釋放機(jī)制的不同可將細(xì)胞外囊泡主要分為外泌體、微囊泡、凋亡小體，它們都參與細(xì)胞間信息傳遞，但目前對于外泌體的研究最多。

表 外泌體與其他細(xì)胞外囊泡的區(qū)別

圖 外泌體與其他細(xì)胞外囊泡

外泌體的結(jié)構(gòu)組成：

外泌體具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，由膽固醇、鞘磷脂和磷酸甘油酯等成分共同組成，在其脂質(zhì)雙分子層的表面附著有粘附分子、主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）、大量的特定蛋白質(zhì)，包括四跨膜蛋白、熱休克蛋白等等和各種特定的配體（CD9、CD63、CD81等）。在外泌體的內(nèi)腔中還攜帶各種生物活性物質(zhì)，包括核酸、某些酶類、蛋白分子、細(xì)胞代謝物等，核酸例如信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）、微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）、脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）和長鏈非編碼核糖核酸（Longnon-coding ribonucleic acid，LncRNA）等。

圖 外泌體的結(jié)構(gòu)組成

外泌體的功能：

外泌體的功能起決于其所來源的細(xì)胞類型。外泌體能夠?qū)⒑怂帷⒌鞍踪|(zhì)和脂質(zhì)在內(nèi)的多種生物活性分子從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊和分子轉(zhuǎn)運(yùn)；并且外泌體可以由所有類型的活細(xì)胞分泌，在體液中廣泛分布。它可參與機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、腫瘤侵襲等方面，因此外泌體在生理病理標(biāo)志物和藥物遞送方面有巨大的應(yīng)用潛力。

外泌體提取：

進(jìn)行外泌體研究，首先要將其從樣本中提取出來。目前已有許多基于外泌體物理及生化特性的分離方法，傳統(tǒng)方法包括超速離心、密度梯度離心、超濾、尺寸排阻色譜（size-exclusionchromatography，SEC）、聚合物沉淀法、免疫親和層析，還有一些新的微流體技術(shù)、商業(yè)試劑盒。

圖 外泌體分離純化方法合集

超速離心：

超速離心法是常用也是分離外泌體的“金標(biāo)準(zhǔn)"方法。其原理是利用溶液顆粒大小和密度導(dǎo)致沉降速率不同，來分離不同組分。該方法包含以下步驟：低速離心去除細(xì)胞和凋亡碎片；其次以更高離心力消除更大囊泡；最后高速離心沉淀外泌體。該方法操作簡便，可以擴(kuò)展為大規(guī)模外泌體制備。在過去30年中，超速離心法被廣泛應(yīng)用于從細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、體液中分離外泌體。但是該方法特異性不強(qiáng)、可混有分子量相近的蛋白質(zhì)，同時(shí)高速離心力可能破壞外泌體膜泡影響下游分析。

圖 超速離心法分離外泌體

密度梯度離心：

密度梯度離心利用顆粒大小與密度差異對外泌體進(jìn)行分離。密度梯度離心會預(yù)先使用蔗糖或碘克沙醇制作密度梯度。樣品從頂部加入離心管，在離心過程中逐漸自上而下沉降，在一定密度區(qū)間聚集。外泌體通常密度范圍為1.1～1.2g/mL。該方法的局限性是分離樣本容量受到密度區(qū)帶寬度的限制，因此密度梯度離心不便于處理大樣本。

圖 密度梯度離心分離外泌體

超濾：

超濾是基于外泌體尺寸進(jìn)行分離的方法。根據(jù)膜孔的尺寸和截留分子量，將小顆粒通過膜孔進(jìn)入濾液，大顆粒截留在膜表面。超濾的主要缺點(diǎn)為液體流動(dòng)方向平行膜孔方向，造成大顆粒堵塞膜孔，同時(shí)產(chǎn)生的剪切力也會使外泌體變形或裂解。

圖 超濾法純化外泌體

尺寸排阻色譜（SEC）：

SEC原理為根據(jù)顆粒尺寸進(jìn)行分離。在色譜柱中填充多孔固定相，小顆粒可以穿過固定相中的空隙，因此沉降路徑變長，較大顆粒更晚沉降，因此可以分離尺寸差別較大的顆粒。通常SEC會*行超速離心預(yù)處理以此減少雜質(zhì)、提高純度。SEC最大的優(yōu)勢是可以很好的保留外泌體活性。

圖 尺寸排阻色譜（SEC）純化外泌體

聚合物沉淀法：

聚合物沉淀原理是利用超親水聚合物，如PEG結(jié)合溶液中水分子使溶質(zhì)溶解度降低進(jìn)而沉淀析出，最后通過低速離心獲得外泌體。可以廣泛用于各種樣品類型，如血液、培養(yǎng)基、尿液、腦脊液等。其優(yōu)點(diǎn)是可處理大樣本，產(chǎn)量較高。缺點(diǎn)是分離的外泌體會受到其他蛋白質(zhì)污染。

圖 聚合物沉淀法純化外泌體

免疫親和層析：

免疫親和層析基本原理通過配體與抗體特異結(jié)合進(jìn)而分離純化。一般用外泌體表面生物標(biāo)記物作為配體，如四跨膜蛋白超家族、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)分類內(nèi)涵體復(fù)合物、復(fù)合物相關(guān)蛋白。抗體吸附在磁珠、多孔二氧化硅單片板、膜親和過濾器上，溶液通過時(shí)可特異結(jié)合外泌體表面蛋白進(jìn)行分離純化。常見方法有基于微孔板的酶聯(lián)免疫吸附測定與磁珠免疫捕獲。此類方法具有高特異性，并可以保證外泌體生物活性。

圖 磁珠法免疫捕獲外泌體

外泌體提取操作步驟：

以磁珠捕獲法提取外泌體、尿液樣本為例（abs9775）：

組分：

1、樣品前處理

取晨尿（中段尿），2500g離心10min以去除細(xì)胞碎片，收集上清，重復(fù)1次，將處理好的尿液放置在-80℃儲存?zhèn)溆谩?/span>

2、外泌體分離純化

1）向10mL的尿液中加入1mL Incubation Solution I上下混勻（若尿液儲存在-80℃,可以在37℃的水浴中解凍后使用）；

2）加入200μL EVtrap magnetic 室溫下孵育0.5-1h，磁吸去上清；

3）加入10mL Incubation Solution Ⅱ上下顛倒混勻20-30次，磁吸去上清；

4）加入5mL Washing Buffer上下顛倒混勻20-30次，磁吸去上清，洗1次；

5）加入1mL Washing Buffer上下顛倒混勻20-30次，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，磁吸去上清；

6）加入200μL的Elution Buffer，渦旋10min；

7）磁吸收集洗脫液，重復(fù)步驟6，將兩次洗脫液共400μL合并到一個(gè)離心管中，渦旋混勻后再瞬離；

8）凍干洗脫液，將凍干后樣品置于-80℃長期保存，或用于下游檢測實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

1）將EVtrap magnetic儲存在4℃，孵育液和洗滌液等儲存在室溫；
2）磁吸時(shí)請使用高磁磁力架，以保證磁珠的外泌體捕獲效果；
3）在任何洗滌步驟中不要?jiǎng)×覝u旋。將樣品上下顛倒20-30次使磁吸后的磁珠結(jié)團(tuán)分散即可；
4）孵育后的操作步驟中，在進(jìn)行上下顛倒混勻時(shí)，動(dòng)作要輕柔，以避免與EVtrap magnetic捕獲的外泌體脫落。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖 使用此外泌體提取試劑盒提取外泌體進(jìn)行WB檢測結(jié)果

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[1] Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020 Feb 7;367(6478):eaau6977. doi: 10.1126/science.aau6977. PMID: 32029601; PMCID: PMC7717626.

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[3] Zhang L, Yu D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019 Apr;1871(2):455-468. doi: 10.1016/j.bbcan.2019.04.004. Epub 2019 Apr 30. PMID: 31047959; PMCID: PMC6542596.

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[5] Gurunathan S, Kang MH, Jeyaraj M, Qasim M, Kim JH. Correction: Gurunathan, S. et al. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells 2019, 8, 307. Cells. 2021 Feb 22;10(2):462. doi: 10.3390/cells10020462. Erratum for: Cells. 2019 Apr 03;8(4): PMID: 33671844; PMCID: PMC7926903.

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