3T3-L1細胞培養及經典“雞尾酒”誘導攻略

更新時間：2023-10-23 點擊次數：878

流行性肥胖是近幾年的一大健康挑戰，肥胖促使一些心血管疾病如高血壓、血栓等發病率增高，糖尿病則是以高血糖為特征的代謝性疾病，長期存在可導致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙。3T3-L1細胞——小鼠胚胎成纖維細胞（前脂肪細胞）系具有向脂肪細胞分化的特性，被廣泛用于研究糖尿病，肥胖癥等。

圖1 3T3-L1細胞形態

表1 3T3-L1基礎培養信息

細胞名稱	3T3-L1（小鼠胚胎成纖維細胞）
來源	18 天左右胎齡的 Swiss 小鼠胚胎
生長方式	貼壁生長
細胞形態	成纖維細胞樣
培養條件	95%空氣、5%CO2、37℃
推薦營養體系	DMEM(abs9483)+10% NBCS(abs978)+1%P/S(abs9244)
傳代	0.25%Try(abs47014937)消化5-15min 1:3-1:4傳代
凍存液配制	培養基+5%DMSO(abs9187)

培養小提示：

1）"Never allow culture to become completely confluent"。細胞匯合度達到70-80%時進行傳代；
2）為了避免細胞聚團，在等待細胞消化的過程中，不要通過擊打或搖晃瓶子來刺激細胞。難以消化的細胞可以放置在37℃；
3）正常培養（非脂肪誘導期）出現空泡時，請優先考慮環境壓力。造成壓力的原因包括培養基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌藥物、培養基中二氧化碳、碳酸氫鈉濃度不當或培養基的營養物質耗盡；
4）使用胎牛血清可能會造成細胞分化！！！

3T3-L1成脂誘導“雞尾酒"策略

圖2 3T3-L1細胞（正常）和3T3-L1成脂分化后（對照）

一般認為，細胞的增值和分化呈負相關，細胞開啟分化必先退出分裂增值周期，常用的方法就是讓其生長至融合期，出現接觸抑制。脂肪生成是一個將碳水化合物和其他底物轉化為脂肪酸，然后作為TAGs（甘油三酯）儲存起來的過程。

經典“雞尾酒"法中，胰島素樣生長因子(IGF-1)激活有絲分裂原蛋白激酶途徑誘導細胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制劑(IBMX)通過激活cAMP依賴性蛋白激酶途徑增強CCAAT/增強子結合蛋白家族(C/EBPs)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ) 表達促進成脂分化、地塞米松促進C/EBPs的表達。

3T3-L1經典成脂誘導過程

誘導步驟：將融合后的3T3-L1（匯合度100%）細胞從DMEM生長培養基切換到含有0.5mmol/L IBMX(abs817348)、10mg/mL胰島素和1μmol/L地塞米松的分化培養基中48h。然后將細胞維持在含有10%FBS和10 mg/mL胰島素的DMEM培養基中48h，之后每隔一天更換常規新鮮培養基，一般第九天染色。

PS：不同產品活性純度不同，濃度僅供參考，不同誘導方案略有差異，IBMX(abs817348)用DMSO溶解時需要超聲破碎。

染色：油紅O儲存液與超純水按3:2稀釋混勻，過濾，避光靜置后酒紅色且無沉淀，現配現用，2h內用完。

用PBS磷酸緩沖液小心漂洗細胞三次，以2mL/孔（六孔板）的劑量加入4%多聚甲醛，室溫固定40min，再用蒸餾水漂洗2次，每孔加入油紅O工作液1mL，常溫染色15min，蒸餾水漂洗至無殘渣，蒸餾水漂洗后加入PBS鏡下觀察。

PS：清洗細胞時動搖要輕柔，防止脂滴脫落，油紅O工作液一定要過濾至無沉淀，否則染色后有殘渣且較難沖洗！！！

“雞尾酒"誘導策略進擊版

有研究者探索了葡萄糖濃度和誘導液2（含10mg/mL胰島素的低糖培養基）的作用時間對3T3L1細胞成脂分化率的影響，結果顯示，低糖培養基誘導時成熟脂肪細胞形成率明顯增高，誘導液2作用時間為3d時，成熟脂肪細胞形成率明顯高于其他組。

圖3 不同葡萄糖濃度對3T3-L1細胞成脂肪分化的影響
Figure2 Results of different time points during adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells

圖4 誘導劑II作用時間對3T3-L1細胞成脂肪分化的影響

圖5 3T3-L1細胞成脂肪分化過程中不同時間點結果記錄（條件下）

注：文中圖片來源于網絡，僅供學習參考用

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貨號	產品名稱	規格
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abs9244	青霉素-鏈霉素溶液（100×，雙抗）	100mL
abs47014937	胰蛋白酶消化液（0.25%，含酚紅）	100mL
abs9187	二甲基亞砜（細胞培養級）	50mL
abs817348	IBMX	25mg
abs9294	油紅O染色液-改良型	3×20mL

參考文獻

[1] Ling HY, Wen GB, Feng SD, Tuo QH, Ou HS, Yao CH, Zhu BY, Gao ZP, Zhang L, Liao DF. MicroRNA-375 promotes 3T3-L1 adipocyte differentiation through modulation of extracellular signal-regulated kinase signalling. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011 Apr;38(4):239-46. doi: 10.1111/j.1440-1681.2011.05493.x. PMID: 21291493; PMCID: PMC3086632.
[2] 張軼博,鐘悅,曾瑞霞.HAmLET誘導小鼠前脂肪細胞3T3-L1成脂分化[J].錦州醫科大學學報,2022,43(04):14-19.
[3] 張曉琴. 優化3T3L1細胞成脂誘導模型并初步探討miR-222-3p對脂肪生成的作用[D].湖北中醫藥大學,2020.

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