外周血單個核細胞攻略

外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）是外周血（即除骨髓以外的血液）中具有單個核的細胞的混合細胞群體，包括自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）、T淋巴細胞（70%-90%）、B淋巴細胞。能夠進一步分離純化，是免疫細胞的主要來源。

表1 PBMC組分及占比

單核細胞（monocyte）是血液中最大的白細胞，來源于骨髓中的造血干細胞，并在骨髓中發育，當它們從骨髓進入血液時仍然是尚未成熟的細胞，與各種細胞因子一起培養，可定向分化為巨噬細胞或樹突狀細胞等。注意不要把單個核細胞和單核細胞兩者的概念混淆。

圖1 單核細胞（左）和淋巴細胞（右）

PBMC是免疫系統的關鍵組成部分，作為免疫學、惡性腫瘤、疫苗研發、移植治療等方向最基礎的實驗原料被廣泛使用。分離外周血單個核細胞成為了免疫細胞研究的基礎，外周血單個核細胞比重為1.070左右，而紅細胞和多核白細胞的比重超過1.080。這樣利用介于兩者比重之間的溶液做密度梯度離心，就可得到單個核細胞。常用的是聚蔗糖和泛影酸鈉混合比重為1.070±0.001的溶液，國內常用泛影葡胺代替泛影酸鈉。

圖2 PBMC分離提取示意圖

PBMC分離提取操作步驟：

1）用無菌稀釋液將血樣稀釋2-4倍；
2）在50ml錐底離心管中先加入15-20ml分離液，然后緩慢加入20-30ml經稀釋的全血或組織細胞懸液至分離液液面之上。（適當增加分離液的使用量，將有利于提高單個核細胞純度）；
3）室溫400g離心15-30min，保證轉子速度平穩下降；
4）將離心管小心地從離心機中取出，緩緩地吸去最上層，避免接觸單個核細胞層；
5）將單個核細胞層緩慢轉移到另一支50ml錐底離心管中；
6）加入無菌洗滌液并混勻后，室溫下300g離心10min，小心棄掉上清；
7）為了去除殘余血小板，可將細胞重懸于30-50ml無菌洗滌液中，室溫200g離心10-15min，小心棄掉上清；
8）可選擇地重復第7步，將會去除絕大部分血小板；
9）將細胞用緩沖液或培養基重懸后進行檢測、培養等后續操作。

此法操作得當，單個核細胞得率可達80%-90%，影響得率最重要的因素是分層液的比重。

圖3 分離培養的PBMC

PBMC激活：

PBMC一般需要加細胞因子刺激，否則很快就會凋亡。推薦使用包被法。

1）六孔板 5μg/mL CD3 800μL（室溫2h 或 4℃過夜）；

2）加入 RPMI-1640培養基(abs9484)+優級胎牛血清(abs972)+1μg/mL CD28+100IU/mL IL-2，細胞密度建議1-2×10⁶/ml, 刺激2-3d；

細胞因子濃度、種類及細胞數量可根據自身實驗目的調整。

PBMC凍存：

10% DMSO(abs9187)+FBS(abs972)

1）制備含20%DMSO的FBS溶液，置于冰上。（100%DMSO在冰上會形成冰晶）;
2）確保PBMC為單細胞懸液。300×g離心10min，棄上清；
3）按1-20×10⁶cells/mL的濃度將PBMC重懸于預冷的FBS中；
4）按1:1的比例將細胞和含20%DMSO的FBS混合。快速將1mL的細胞懸液轉移到凍存管；
5）將凍存管立即放入梯度降溫盒中，在-80℃的冰箱中放置過夜后立即轉入液氮。

PBMC離體之后越快冷凍越能保證其活性及功能。當全血離體一段時間后，再使用Ficoll進行分離，中性粒細胞會被活化，從而嚴重影響密度梯度離心得到PBMC的效率，從靜置24h后的模擬運輸環境中分離得到的PBMC，其組分中T細胞和NK細胞含量會發生明顯變化，對刺激的反應也會弱化。

今天的文章就到這里啦，PBMC還有很多相關實驗，歡迎大家公主號“愛必信生物"后臺留言，一起探討更多細胞培養問題。

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* 注：文中圖片來自網絡，僅供學習參考用

Gebauer B S, Hricik D E, Atallah A, et al. Evolution of the enzyme‐linked immunosorbent spot assay for post‐transplant alloreactivity as a potentially useful immune monitoring tool[J]. American journal of transplantation, 2002, 2(9): 857-866.

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