外泌體miRNA可通過細胞衰老途徑參與結腸炎發生？

外泌體是直徑為30-200nm的小囊泡，幾乎來自所有細胞^[1]。外泌體中包裹了RNA、DNA、蛋白質和脂質，通過在不同細胞之間的傳遞，介導多種生理和病理過程。作為小的非編碼單鏈RNA，microRNAs (miRNAs)通過轉錄后抑制基因表達，顯著調節細胞生長和代謝，可以被包裝在外泌體中以防止RNase的消化并進入循環，可作為潛在的疾病生物標志物^[2]。

圖1 外泌體miRNA分泌機制

2023年8月7日，武漢大學人民醫院董衛國教授團隊在國際學術期刊Gut Microbes在線發表了題為“Exosomal-miR-129-2-3p derived from Fusobacterium nucleatum-infected intestinalepithelial cells promotes experimental colitisthrough regulating TIMELESS-mediated cellular senescence pathway"研究性論文（IF 12.2）。該研究揭示了具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)通過外泌體加重潰瘍性結腸炎(UC)的分子機制，為UC的診斷和靶向治療提供了新的理論支持。

圖2 文章信息

核梭桿菌(Fn)感染可加劇潰瘍性結腸炎(UC)。然而，Fn感染的腸上皮細胞(IEC)衍生外泌體(Fn-Exo)與UC進展之間的聯系尚未被研究。該研究通過miRNA測序鑒定了Fn-Exo和未感染的IEC衍生外泌體(Con-Exo)中差異表達的miRNA。然后，在體外和體內確定Fn-Exo在UC發育中的生物學作用和機制。作者發現外泌體將miR-129-2-3p從Fn感染的IECs傳遞到未感染的IECs，加劇上皮屏障功能障礙和實驗性結腸炎。機制上，Fn-Exo通過miR-129-2-3p/TIMELESS軸誘導DNA損傷，隨后激活ATM/ATR/p53通路，最終促進細胞衰老和結腸炎癥。總之，Exo-miR-129-2-3p/TIMELESS/ATM/ATR/p53通路加重了細胞衰老、屏障損傷和實驗性結腸炎。目前的研究揭示了Fn感染性UC進展中的一個前所未知的調控途徑。此外，血清中的外泌體-miR-129-2-3p可能作為UC和Fn-high-UC的新型潛在診斷生物標志物^[3]。

圖3 Fn-Exo在結腸炎中的作用和機制示意圖

一、愛必信擁有全套的外泌體&miRNA解決方案

圖4 愛必信外泌體&miRNA解決方案

1、miRNA提取

一般來說，傳統的TRIzol及其它常用的RNA提取試劑盒提取的是較大分子的RNA，包括rRNA和mRNA，但對miRNA的提取效果不佳。這可能是因為如此小的核酸分子不易被醇類沉淀、也不易被核酸純化膜和磁珠吸附捕捉的原因。因而，要較好地提取miRNA，必須采取一些新的思路和方法。根據目前的研究結果顯示，miRNA富集法應該是一種不錯的選擇。其原理為，先使用富集試劑將含量較低、分子量較小的miRNA聚集在一起，再使用核酸純化柱進行提取。顯然，miRNA聚集后更加有利于miRNA的吸附和捕捉，從而得以有效地提升miRNA的提取得率。

愛必信研發了可高效提取各樣本中miRNA的專門試劑盒，與部分同類試劑盒相比，顯著提升了miRNA的提取效率。

1）采用特殊的消化技術，去除較大分子的DNA和rRNA, 使miRNA更容易分離提取
2）采用miRNA富集技術，使miRNA聚集起來，使之更容易被核酸純化膜吸附純化，大幅提升miRNA的提取效率；
3）操作簡便，只需30多分鐘即可獲得理想的miRNA提取結果。

2、miRNA逆轉錄&qPCR

miRNA逆轉錄的難點在于其分子較小，逆轉錄引物無法理想地與miRNA結合。顯然，進行miRNA逆轉錄時，需要對miRNA分子進行加長改造。有兩種方法可達到這一目的：一種采用Poly(A)加尾法，另一種采用莖環法。對于加尾法逆轉錄來說，miRNA能否有效加長的關鍵在于Poly(A)聚合酶的活性。Poly(A)聚合酶活性高，就可以在短時間內給miRNA加上較長的Poly(A)尾巴，使miRNA分子能夠高效地結合Oligo(dT)引物。另外Oligo(dT)引物的設計也至關重要，如果是簡單的Oligo(dT)，引物與miRNA的結合往往會發生錯位，導致逆轉錄效率降低。高效的Oligo(dT)引物應該加入錨定堿基，從而使二者的結合更加特異高效。莖環法逆轉錄成功的關鍵在于莖環的設計，該莖環應能高效地與miRNA 3’端特異、高效地結合，同時還要能夠順利地折疊和打開。

miRNA qPCR相對較為簡單，主要有染料法和探針法。兩種方法相比，探針法特異性更強。不過如果miRNA能夠高效提取，并且miRNA qPCR逆轉錄成功，無論miRNA qPCR選擇何種方法，一般都會有較為理想的結果。

二、加尾法逆轉錄VS頸環法逆轉錄如何選擇？

選擇何種miRNA逆轉錄以及定量方法，主要由實驗來決定。對于從事較多miRNA（3個以上）研究的研究者來說，選用加尾法逆轉錄試劑盒較好，因為一次逆轉錄后可以進行多個miRNA的qPCR擴增，省去了很多的實驗操作。但對于只檢測1-2個miRNA的研究者來說，選用莖環法比較合適，因為莖環法逆轉錄結果更加特異。

需要特別注意的是，miRNA逆轉錄試劑盒和miRNA qPCR試劑盒一般是配套使用的，研究者最好買我公司配套的miRNA逆轉錄試劑和qPCR試劑，否則，有可能出現實驗失敗。其主要原因是逆轉錄引物上往往設計有qPCR引物結合序列，如果買不同廠家的試劑，qPCR引物可能無法特異地結合逆轉錄產物。另外，對于初學者而言，miRNA上游引物的設計有一定難度，往往既花了時間，又得不到好的實驗結果，建議最好購買能夠贈送上游引物的逆轉錄試劑生產廠家。

1）凡購買miRNA逆轉錄和定量試劑盒一套，即可免費獲得逆轉錄&qpCR引物；
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[1] Pegtel DM, Gould SJ. Exosomes. Annu Rev Biochem. 2019;88:487–514. doi: 10.1146/annurev-biochem-013118-111902.

[2] Jeppesen DK, Fenix AM, Franklin JL, Higginbotham JN, Zhang Q, Zimmerman LJ, Liebler DC, Ping J, Liu Q, Evans R, et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 2019;177(2):428–445.e18. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.029.

[3] Wei S, Wu X, Chen M, Xiang Z, Li X, Zhang J, Dong W. Exosomal-miR-129-2-3p derived from Fusobacterium nucleatum-infected intestinal epithelial cells promotes experimental colitis through regulating TIMELESS-mediated cellular senescence pathway. Gut Microbes. 2023 Jan-Dec;15(1):2240035. doi: 10.1080/19490976.2023.2240035. PMID: 37550944; PMCID: PMC10411316.

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