國自然熱點課題 | 線粒體功能檢測方法全解析

線粒體是在真核細胞中由雙層高度特化的單位膜圍成的半自主性細胞器，能產生能量以維持細胞正常的生理活動。大量研究表明，在生物的生長、發育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進化等方面，線粒體參與其中進行調控或信號傳導，且還參與細胞內Ca²⁺的穩態、活性氧（ROS）的產生以及細胞色素C的釋放^[1]。關于線粒體的研究在近十年來仍呈爆發式增長，也是近年來高分文章的焦點之一。

圖1 Ca²⁺和ROS/RNS在線粒體能量產生中的作用^[1]。

目前文獻中對于線粒體的研究主要有兩個方面：一是形態結構的檢測；二是線粒體功能的檢測及分析。

線粒體形態結構的檢測

電子顯微鏡（electron microscope, EM）技術是觀察和分析線粒體結構的金指標。其中，透射電子顯微鏡是線粒體形態學檢查的有力工具，也是觀察線粒體超微結構及其相關基因突變或生理條件引起的變化、線粒體與其他細胞膜（如內質網或質膜）間相互作用的必要方法。此外，由于特異性強，免疫電鏡已成為觀察線粒體相關蛋白質定位的較好方法。

線粒體功能的檢測及分析

線粒體形態和功能密切相關，通常線粒體伸長、呼吸或膜電位的增加與改善的線粒體功能相一致^[2]。相反，活性氧（ROS）增加、線粒體鈣水平升高或線粒體斷裂可能表明功能障礙^[3-4]。活細胞線粒體染料包括DASPEI、4-Di-1-ASP等，對于線粒體功能的檢測及分析可以從以下幾個方面探究。

線粒體Ca²⁺ 測定

鈣（Ca²⁺）在許多生物系統中起著至關重要的作用，包括信號轉導、血液凝固、離子跨膜轉運、酶的激活和細胞分裂等方面。線粒體Ca²⁺ 被稱為氧化磷酸化的中心調節劑，在細胞內，鈣離子主要儲存在線粒體和內質網等細胞器中，Ca²⁺ 在調節線粒體代謝、保持細胞所需的線粒體ATP產量、通過ATP合成酶的磷酸化在ADP中發揮著重要作用。熒光探針Fluo 3-AM和Fluo 4-AM可以測量線粒體中的鈣含量。這種方法適用于各種活體細胞內線粒體Ca²⁺ 的濃度檢測，操作簡便、性能穩定，具有較高的靈敏性。

活性氧的檢測

正常情況下，細胞內抗氧化防御系統與氧自由基處于平衡狀態，細胞內活性氧（ROS）的水平維持在較低的生理范圍。在病理情況下，細胞內抗氧化系統與氧自由基的平衡被打破，細胞內活性氧水平過多，就可破壞線粒體的酶類、脂類和核酸，使機體出現氧化應激，同時活性氧還可攻擊線粒體DNA產生氧化損傷，導致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結構和功能變化。因此，我們可以通過檢測活性氧的多少來測定線粒體的功能是否正常。ROS可采用熒光探針DCHF-DA染料測定；DCHF-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞后，細胞內的酯酶水解生成DCHF，而DCHF不能出入細胞膜從而使探針很容易被標記到細胞內。在活性氧的存在下，DCHF被氧化生成熒光物質DCF，其熒光強度與細胞內活性氧水平成正比，檢測 DCF的熒光就可以知道活性氧的水平。

線粒體膜電位

線粒體內膜兩側通常出現負電位差（?180 mV~ ?200 mV），這就是線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential, MMP, Δψm）。MMP的變化甚至微量變化，都會極大地影響線粒體的功能。線粒體功能與細胞穩態密切相關，MMP的異常變化會進一步導致線粒體疾病。監測MMP是評估線粒體功能狀態的常用方法。目前常用的是采用熒光染料探針方法結合流式細胞術來檢測線粒體膜電位。親脂陽離子熒光染料是評估M M P的常用工具（表1）。

表1 線粒體膜電位檢測常用熒光染料

圖2 熱應激損傷成肌細胞線粒體的生物發生和功能^[5]。

成肌細胞在增殖（A）和分化（B）過程中JC-1染色的代表性圖像。（C）紅色熒光與綠色熒光的比率。（D）成肌細胞增殖和分化過程中的電子顯微鏡。紅色箭頭表示線粒體（比例尺: 500 nm）。

線粒體膜通透性轉換孔（MPTP）檢測

線粒體膜通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）是線粒體滲透轉換功能的結構基礎，是線粒體內外膜結合處的一種蛋白性通道。它對細胞內多種離子濃度變化非常敏感, 特別是對細胞內信號傳導系統有重要作用。在細胞凋亡或壞死時，線粒體內容物通過膜通道孔釋放到胞漿中^[6]。膜通道孔的開放，顯著改變了線粒體的通透性。鈣離子過度進入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導致膜通道孔的持續開放，而造成細胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失^[7]。鈣黃綠素-AM是一種活體細胞線粒體MPTP熒光檢測試劑，通過鈣黃綠素-鈷技術（聚集在線粒體內的鈣黃綠素呈現熒光染色，而存在于胞漿或由線粒體釋放到細胞質中的熒光染料即刻發生熒光淬滅）來分析和觀察線粒體膜通道孔活性。

此外，對線粒體的功能研究還可以從線粒體ATP測定、線粒體呼吸鏈復合體活性測定、線粒體DNA的檢測等方面進行研究。線粒體功能檢測的理想研究還應包括其他檢測的組合，如完整分離的線粒體、透化細胞或組織中氧消耗的測量、ATP的合成、用放射性標記的底物進行氧化研究和測定線粒體的運動等，并可以對線粒體的功能障礙進行靈敏檢測。還可以通過測定線粒體的代謝物活力，如檢測丙酮酸、乳酸、乳酸脫氫酶等的水平來檢測線粒體的功能^[8]。

[1] Castora F J .Mitochondrial function and abnormalities implicated in the pathogenesis of ASD[J].Progress in Neuro Psychopharmacology & Biological Psychiatry, 2019, 92:83-108.DOI:10.1016/j.pnpbp.2018.12.015.

[2] Gao G, Wang Z, Lu L, et al. Morphological analysis of mitochondria for evaluating the toxicity of alpha-synuclein in transgenic mice and isolated preparations by atomic force microscopy. Biomed Pharmacother, 2017, 96: 1380-1388.

[3] Ferraresi C, Kaippert B, Avci P, et al. Low-level laser (light) therapy increases mitochondrial membrane potential and ATP synthesis in C2C12 myotubes with a peak response at 3-6 h. Photochem Photobiol, 2015, 91(2): 411-416.

[4] 楊建, 高瑩, 史慧妍等.線粒體功能障礙與高血壓.中國動脈粥樣硬化雜志, 2017, 25(10): 1061-1066.

[5] Lu JW, Li HX, Yu DB, et al. Heat stress inhibits the proliferation and differentiation of myoblasts and is associated withdamage to mitochondria[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology,2023. 

[6] Castora FJ. Mitochondrial function and abnormalities implicated in the pathogenesis of ASD. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2019, 92: 83-108.

[7] Chen MX, Ward E, Caivano M, et al. Probing mitochondrial permeability transition pore activity in nucleated cells and platelets by high-throughput screening assays suggests involvement of protein phosphatase 2B in mitochondrial dynamics. Assay Drug Dev Technol, 2018, 16(8): 445-455.

[8]肖晨,陳思君,危當恒,等.線粒體功能的檢測方法[J].生命的化學, 2020, 40(2):8.

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