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                多色結(jié)果不理想?快進來看看是怎么個事兒

                更新時間:2023-07-14      點擊次數(shù):945

                Q:我的結(jié)果拍出來全視野都是熒光信號(如下圖),這是怎么回事呀?



                 

                A:這個成像的情況多半是過曝啦!造成過曝的原因就是儀器的曝光時間設(shè)置不合適,我們的熒光染料強度比一般的染料都要強,且不容易淬滅,一般情況下在3-5ms的曝光時長就能夠有熒光信號了,最長也不會超過20ms(除非是放了很久發(fā)生淬滅的片子),您可以看一下您的顯微鏡/掃描儀的曝光時長,如果時間過長就會出現(xiàn)全片都是熒光信號的情況。如果您不是手動設(shè)置的曝光時長,是儀器自動曝光的,那出現(xiàn)這種情況有可能是您的陽性信號太弱了,儀器在短曝光時長沒有信號,所以自動延長了曝光時長再拍,這就有可能把背景大量曝出來。您可以嘗試手動進行曝光時長調(diào)整,如果縮短時長以后背景變?nèi)醯栃孕盘栆埠苋酰托枰{(diào)整抗體濃度和抗體孵育時間;如果縮短時長以后背景依舊很強,請確認染料是否孵育時間過長,我們的染料孵育最長不超過10min,甚至3-5min就已經(jīng)能夠孵育出信號了,時間過長就會出現(xiàn)全片都是信號的情況。

                 

                Q:我染出來的結(jié)果怎么有一些位置所有通道都有顏色?而且也不是陽性信號



                 

                A:這個情況是因為這個位置壞死或者沒處理干凈,導致這種位置可能有大量蛋白碎片或者是組織液,亦或者是血液,這些雜質(zhì)都有可能吸附我們的TSA染料,染料的大量沉積,導致這些位置出現(xiàn)強非特異性。所以咱們在取材的時候,盡量避開壞死區(qū)域,像灌流清潔這些前處理也要做好,樣本的質(zhì)量決定最終染色的質(zhì)量哦。(經(jīng)驗之談:血細胞容易吸附短波長的染料,如果有些樣本確實沒辦法灌流更干凈了,可以考慮避開這些染料,至于具體是哪些染料,各廠家有些微區(qū)別,Absin這邊主要是TSA480容易吸附血細胞,如下圖)


                 

                Q:這個指標我做免疫熒光的時候效果很好的,怎么你們多色做出來信號不對?


                左IF;右mIHC

                 

                A:首先您需要確認您的抗體是否有IHC應(yīng)用哦,如果您用的是IF的抗體,跟我們這個實驗就不太符合哦,我們多色的熒光染料是獨立在抗體之外的,需要通過HRP的二抗去催化顯色,跟IHC里面用HRP二抗催化DAB顯色類似,所以需要IHC應(yīng)用的抗體,免疫熒光則是把熒光素直接連接在抗體上,所以大家在一抗上面還是有些區(qū)別。另外,如果您手里的抗體廠家寫了既能做IF也能做IHC,那我們多色的效果需要跟免疫組化(IHC)的效果去做對比哦,您可以染一個免疫組化看一下形態(tài)樣子、背景情況,看看跟多色是否相似,如果組化背景不干凈,多色也會有很高背景哦。

                 

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                四色多重熒光免疫組化染色試劑盒(兔二抗)

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                五色多重熒光免疫組化染色試劑盒(兔二抗)

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