多色結(jié)果不理想？快進(jìn)來看看是怎么個事兒

Q：我的結(jié)果拍出來全視野都是熒光信號（如下圖），這是怎么回事呀？

A：這個成像的情況多半是過曝啦！造成過曝的原因就是儀器的曝光時間設(shè)置不合適，我們的熒光染料強度比一般的染料都要強，且不容易淬滅，一般情況下在3-5ms的曝光時長就能夠有熒光信號了，最長也不會超過20ms（除非是放了很久發(fā)生淬滅的片子），您可以看一下您的顯微鏡/掃描儀的曝光時長，如果時間過長就會出現(xiàn)全片都是熒光信號的情況。如果您不是手動設(shè)置的曝光時長，是儀器自動曝光的，那出現(xiàn)這種情況有可能是您的陽性信號太弱了，儀器在短曝光時長沒有信號，所以自動延長了曝光時長再拍，這就有可能把背景大量曝出來。您可以嘗試手動進(jìn)行曝光時長調(diào)整，如果縮短時長以后背景變?nèi)醯栃孕盘栆埠苋酰托枰{(diào)整抗體濃度和抗體孵育時間；如果縮短時長以后背景依舊很強，請確認(rèn)染料是否孵育時間過長，我們的染料孵育最長不超過10min，甚至3-5min就已經(jīng)能夠孵育出信號了，時間過長就會出現(xiàn)全片都是信號的情況。

Q：我染出來的結(jié)果怎么有一些位置所有通道都有顏色？而且也不是陽性信號

A：這個情況是因為這個位置壞死或者沒處理干凈，導(dǎo)致這種位置可能有大量蛋白碎片或者是組織液，亦或者是血液，這些雜質(zhì)都有可能吸附我們的TSA染料，染料的大量沉積，導(dǎo)致這些位置出現(xiàn)強非特異性。所以咱們在取材的時候，盡量避開壞死區(qū)域，像灌流清潔這些前處理也要做好，樣本的質(zhì)量決定最終染色的質(zhì)量哦。（經(jīng)驗之談：血細(xì)胞容易吸附短波長的染料，如果有些樣本確實沒辦法灌流更干凈了，可以考慮避開這些染料，至于具體是哪些染料，各廠家有些微區(qū)別，Absin這邊主要是TSA480容易吸附血細(xì)胞，如下圖）

Q：這個指標(biāo)我做免疫熒光的時候效果很好的，怎么你們多色做出來信號不對？

左IF；右mIHC

A：首先您需要確認(rèn)您的抗體是否有IHC應(yīng)用哦，如果您用的是IF的抗體，跟我們這個實驗就不太符合哦，我們多色的熒光染料是獨立在抗體之外的，需要通過HRP的二抗去催化顯色，跟IHC里面用HRP二抗催化DAB顯色類似，所以需要IHC應(yīng)用的抗體，免疫熒光則是把熒光素直接連接在抗體上，所以大家在一抗上面還是有些區(qū)別。另外，如果您手里的抗體廠家寫了既能做IF也能做IHC，那我們多色的效果需要跟免疫組化（IHC）的效果去做對比哦，您可以染一個免疫組化看一下形態(tài)樣子、背景情況，看看跟多色是否相似，如果組化背景不干凈，多色也會有很高背景哦。

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