IF=63.714！丨mRNA高分文獻不容錯過

2021年8月19日，張鋒團隊在國際學術期刊Science上發表了題為：Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery 的研究論文。

研究團隊開發了一種全新的RNA遞送平臺——SEND（Selective Endogenous eNcapsidation for cellular Delivery），SEND的核心是逆轉錄病毒樣蛋白PEG10，它能夠與自身的mRNA結合并在其周圍形成球型保護囊。研究團隊將其改造設計后用來包裝和遞送RNA，使用SEND系統將CRISPR-Cas9基因編輯系統遞送給小鼠和人類細胞并成功編輯了目標基因，這將為基因治療提供一種全新的遞送載體。SEND系統是利用人類內的組分自組裝為病毒樣顆粒，與其他遞送載體相比，所引起的免疫反應更少，更具安全性。

哺乳動物細胞形成Gag同源物的計算篩選

為了鑒定具有轉移特定核酸潛力的基因，研究人員專注于包含核心衣殼(CA)結構域的Gag同源物，該結構域保護逆轉錄轉座子和外源逆轉錄病毒的基因組?；蚪M分析確定了哺乳動物基因組中的許多內源性Gag同源物，形成分泌在細胞外囊泡內的衣殼樣顆粒（EVs）。

圖1 鑒定形成衣殼并被分泌的哺乳動物逆轉錄元件衍生的Gag同源物

MmPEG10 結合并分泌其自身的mRNA

為了確定這些蛋白質是否在EV內分泌，研究人員在人胚胎腎（HEK）293 FT細胞中過表達每個含CA基因的表位標記小鼠直向同源物，并收集全細胞裂解物和病毒樣顆粒（VLP）。

圖2 MmPEG10蛋白和mRNA在體外由細胞分泌到囊泡中

結果表明，MmMOAP1、MmArc、MmPEG10和MmRTL1都存在于VLP級分中，但MmPEG10是VLP級分中豐富的蛋白質。此外，內源性MmPEG10，很容易在無細胞成年小鼠血清中檢測到。
 

接下來，研究人員使用RNA測序測試了由Gag同源物形成的任何衣殼樣顆粒是否包含特定的mRNA。發現MmPeg10轉錄激活導致可觀數量的全-VLP部分中的長度MmPeg10 mRNA轉錄本。

圖3 帶有MmPeg10的5和3’UTR的側翼mRNA能夠將mRNA功能性地細胞間轉移到靶細胞中

PEG10是一個進行RNA傳遞的模塊化平臺

為了生成內源性的SEND系統，研究人員測試了VSVg是否可以被內源性融合跨膜蛋白替代。鑒于MmPeg10/HsPEG10和合胞素基因的重疊組織表達，還測試了用MmSYNA或MmSYNB對小鼠SEND系統進行假型與使用VSVg進行假型的可行性。結果表明，這種細胞類型適合通過這些融合素進行轉導。
 

研究人員將轉導增強劑vectofusin-1添加到MmSYNA和MmSYNB顆粒的上清液中，以增強體外轉導。在這些原代細胞中，VSVg和MmSYNA都啟用了SEND介導的Mm.cargo(Cre)功能轉移，而MmSYNB則沒有。

同樣，這種包裝是高度特異性的，因為只有UTR側翼的mRNA[即Mm.cargo(Cre)]被功能轉移。與MmSYNA一起，SEND可以配置為功能基因轉移的內源系統。

圖4 SEND 是一個模塊化系統，能夠將基因編輯工具傳遞到人類和小鼠細胞中

之后研究人員開始探索MmPEG10介導的MmPeg10 RNA在神經元中的內源性作用。攜帶天然PEG10轉錄本的MmSYNA假型VLP的功能轉移到原代小鼠皮層神經元，導致許多參與神經發育的基因上調。

為了進一步表征該系統組件的模塊化，研究人員測試了不同的貨物RNA。測試了SEND 是否可以介導大約5kb Mm.cargo（SpCas9）的功能轉移到N2a細胞系中，這些細胞系組成性表達針對MmKras的單一向導RNA（sgRNA）。

SEND能夠在功能上轉移SpCas9，導致受體細胞中約60%的插入和缺失（indels）；與Cre的結果相似，SEND是特異性的，只能有效地功能轉移SpCas9，兩側是全長或優化的Peg10 UTR序列。

為了創建用于遞送sgRNA和SpCas9的多合一載體，研究人員測試了SEND是否可以有效遞送sgRNA。并將它們與表達Cas9的N2a細胞一起孵育；即使直接轉染向導顯示強大的插入缺失形成，也可以檢測到非常少的活性。

圖5 SEND是一個模塊化系統，能夠將基因編輯工具傳遞到人類和小鼠細胞中

作者表示SEND技術可以補充現有的病毒遞送載體和脂質納米顆粒，以擴展向細胞遞送基因和編輯療法的工具箱。

Segel M, Lash B, Song J, Ladha A, Liu CC, Jin X, Mekhedov SL, Macrae RK, Koonin EV, Zhang F. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. Science. 2021 Aug 20;373(6557):882-889.

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