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Q1：我該如何得到很好的多色結果呢？
A1：首先，您需要有質量不錯的樣本和抗體，這就已經是成功的一半（樣本、抗體選擇攻略），對于樣本來說，脫片是我們需要預防的“頭號公敵"，多色實驗需要重復熱修復洗脫抗體多次，假如片子脫片，輕則成像模糊，重則組織脫落前功盡棄，可以在開始實驗之前先模擬幾輪熱修復，不加抗體和其他試劑，看看組織是否有脫落的跡象，如果脫落比較嚴重，則需要重新制備切片，如果有輕微脫片，則可以考慮購買抗體洗脫液（abs994），替代熱修復的過程；然后，就可以開始做實驗了，我們建議您*行抗體和染料工作條件摸索，再上多染（參考下圖流程），這樣多染的成功率可以達到90%以上哦?。ㄐ劢涷炛?，即便是染了千百遍的常見指標，換個樣本，染色效果就可能天差地別，有條件還是建議要做預實驗。）
最后的10%，就需要調整指標與染料搭配以及染色的順序了。
Q2：有沒有推薦的染料搭配和染色順序呢？
A2：染料搭配一般遵循“寡靶配強光，眾靶配弱光"的原則，意思是表達比較弱的指標搭配熒光信號比較強的染料，表達相對強的指標搭配信號比較弱的染料，Absin的TSA染料波長越短熒光強度越強，比如說需要染PD-1，CD8和CD3，我們手里有一個四色試劑盒（TSA520/TSA570/TSA650），通過IHC發現樣本中PD-1的信號很少，CD3信號非常多，其次是CD8，于是選擇TSA520搭配PD-1，TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比較合理。
接下來就是怎么安排染色先后順序：
1）劃分細胞定位，先外后內：確定每個指標的細胞定位，膜表達先染，胞漿或者胞核的后染（如果是指標比較多的情況下，胞內指標排在比較后面，經過前期多輪洗脫，可以不做細胞通透；如果指標很少，染胞內指標之前還是需要打孔，多個胞內指標也只需要打一次孔）；
2）確定抗原修復方式，先酸后堿：堿修復比酸修復的力度會更強，個別抗體在用堿修復以后會染出來很多非特異性，所以如果是相同的細胞定位，就先染酸修復，再染堿修復的抗體；
3）根據IHC結果判別，先弱后強：組化結果顯示指標比較少，比較弱的，排在前面染，理論上來說越靠前染的指標效果會越接近單標染色。
以上就是一些通用規則，但不同的指標還是可能出現變化，要想得到較好的結果，就需要不同的排列組合一個一個嘗試（如下表，“X"代表有信號），這樣會比較耗費時間和試劑，您可以根據通用規則先行一次多染，然后各通道跟熒光單染做對比，如果效果差別很大，那就再調整染色順序，如果單染的結果跟組化差別比較大（出現高背景，非特異性明顯），就要考慮更換染料搭配。
Target | Best Signal | Recommended | ||
1st AR | 3rd AR | 6th AR | ||
FOXP3 |
|
| x | 1:250 |
PD-1 | x |
|
| 1:250 |
LAG3 |
| x | x | 1:250 |
CD4 |
| x | x | 1:250 |
Q3：我成像完了以后想要做數據分析，你們有什么軟件推薦嗎？
A3：目前市面上數據分析軟件還是比較多的，像免費的您可以下載imageJ、Qupath，缺點就是用法都需要您自行摸索；我們公司安裝的是HALO和StrataQuest兩款軟件，HALO是付費的，StrataQuest是我們TG的掃描儀平臺自帶的，從功能、分析的精準度和可操作性來說，肯定是大大優于開源軟件的，且有軟件專業的技術支持團隊能夠答疑解惑。您可以根據您的實際情況選擇合適的分析軟件，如果您實在無從下手，也可以找Absin，我們可以提供數據分析的服務~
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Absin病理抗體指標大全 | |
CD相關抗體 | CD3、CD8a、CD4、CD68、CD206、CD163、CD20、CD19、CD45、CD56、CD10、CD117、CD138、CD14、CD146、CD15、CD1a、CD2、CD21、CD23、CD25、CD30、CD31、CD34、CD35、CD38、CD3G、CD44、CD5、CD7、CD79a、CD79B、CD99 |
角蛋白（CK）相關抗體 | panCK、CK-4、CK HMW、CK-1、CK-10、CK-14、CK-17、CK-18、CK-19、CK-20、CK-5、CK-5&6、CK-6、CK-7、CK-8、CK-8&18 |
癌癥腫瘤相關 | p120、p16、p21、p40、p53、p63、AFP、ALK、AMACR、ANXA1、Aurora-B、Bcl-6、CTNNB1、CA125、CDK4、CDX2、CEA、CCND1、c-MET、c-Myc、DOG1、CDH1、EGFR、EpCAM、ERG、EZH2、FABP3、FGFR2、FOXP1、GATA-3、GCDFP-15、GPC3、GZMB、HER-2、IDH1 R132H、Ki-67、LDLR、MCM7、MCM3、MGMT、MSH2、MSH6、MUC1、MUC2、MUC4、MUM1、MyoD1、Myogenin、Myosin (Smooth Muscle)、Napsin-A、N-Cadherin、Olig2、PAX-2、PAX-5、PAX-8、PCT、PD-1、PHH3、PLAP、PMEL-17、PDPN、PR、PSA、PSAP、S100A1、S100P、SALL4、SATB1、SF-1、SOX10、SOX11、SOX2、STAT6、Stathmin、TCL1、TFE3、TG、TLE1、TOP2A、TPO、TRPS1、TTF-1、Type I Cytokeratins、Type II Cytokeratins、Uroplakin III、Villin、WT1、ZAP-70 |
神經相關 | ATRX、p75 NGF Receptor、CgA、DDX4、GFAP、λLight Chains、MBP、NeuN、Neurofilament、NSE、Olig2、p75 NGF Receptor、S100、SYP |
血管 | ACE2、VEGF、VWF |
鈣蛋白 | CALB1、Caldesmon、Calponin、Calcitonin、Calprotectin |
其他 | MPO、AR、Arg-1、AR-V7、B2M、CLDN1、Collagen Type Ⅳ、COL4A5、ERα、GH、HBSAg、hCG、hCG-beta、hPL、IgD、IgG、IgM、IGFBP3、Insulin、Oct3/4、SCGN、Somatostatin、TDT、Actin、Desmin |
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