多重熒光免疫組化Q&A（第二彈）

Q1：為什么每染一個抗體就要做抗原修復呢，我可以只在第一個指標做，后面不做嗎？

A1：不可以的，每染完一個抗體都是需要做抗原修復的。染第一個抗體之前做抗原修復，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來，使得抗體能夠識別到抗原；在染后面每一個抗體之前的抗原修復，目的是為了去除掉上一輪染色的抗體和殘留沒有結合上的染料，其實更準確的叫法是“抗體洗脫"，因為我們做多色實驗，沒有限制一抗的來源，您的一抗可能都是來源于兔子，那我們對應每一個一抗所使用的二抗都是抗兔，如果不洗脫前一個一抗，染第二個抗體的時候，二抗也會和上一輪的一抗結合，產生大面積非特異性染色，所以抗體洗脫是整個多色實驗不能缺少的核心步驟。

Q2：抗原修復液（抗體洗脫液）每一輪修復都要更換嗎？

A2：需要的，首先我們的抗原修復液需要根據下一輪要染的一抗來選擇，有的一抗需要用檸檬酸修復，有的又需要EDTA修復，抗體廠家往往會注明他們的抗體需要用什么修復液；其次，就算我們所有的一抗都是推薦用檸檬酸修復，但每洗脫完一個指標，修復液中都會殘留上一個指標的抗體，如果重復使用修復液，會對后面的指標產生影響，導致非特異性染色。

Q3：我的組織有自發熒光，我還能做多色嗎？

A3：一般情況下是可以的。首先，您可以用熒光成像設備直接觀察您白片（不做任何處理的組織切片）的自發熒光情況，可以每一個通道都成像試試，看看自發熒光具體是在哪個或者哪些通道能夠觀察到；確定了自發熒光大概的波長范圍以后，我們在選擇多色染料的時候，要避開自發熒光所在的波長，比如您的自發熒光在FITC通道能夠觀察到，在其他通道都沒有，那對應Absin多色染料有重合的就是TSA520，在染多色的時候只要不選TSA520即可。當然我們為了避開自發熒光通道，勢必要舍棄一些染料，那最后能染的顏色數量也會相應減少，并且假如您發現樣本在您儀器的所有熒光通道都能觀察到信號，那這個樣本就不適合用來做多色了，需要重新制備樣本。

Q4：微波修復，高壓修復，抗體洗脫液洗脫，這幾種修復方式做出來的染色效果差別大嗎？

A4：修復方式對染色效果的影響其實視一抗和樣本來定。對于大部分的石蠟樣本，我們推薦用高壓熱修復，這種修復方式是大家一直認為比較好的修復方式，Absin實驗室一直采用的也是高壓熱修復，當然微波熱修復效果也不錯，但不同微波爐的性能不同，所以工作條件不能復刻，需要做一些摸索，并且微波熱修復可能會持續比較長的時間，容易導致修復液蒸干影響效果。而抗體洗脫液主要是針對一些無法采用熱修復或者熱修復容易脫片的樣本（如冰凍切片、硬骨切片等），工作條件更溫和，洗脫效果則取決于切片厚度、洗脫溫度和時間、一抗種類（洗脫難度：結構性膜蛋白和細胞骨架蛋白 > 胞漿蛋白 > 胞核蛋白）。對于能夠經得起多輪熱修復的樣本，我們更推薦采用熱修復。

Q5：做多色實驗，除了多色試劑盒以外，我還需要準備什么材料呢？

A5：我們試劑盒里面包含TSA熒光染料、染料稀釋液、二抗、DAPI、抗熒光淬滅封片劑，除了這些以外的試劑都是需要您自己準備的，按照免疫組化的試劑準備即可。最重要的是您需要配備熒光成像設備。

Q6：我們實驗室有熒光設備，但我不知道能否用來觀察多色？

A6：您需要確認您的熒光設備各個通道的激發波長和發射波長（可以咨詢儀器廠家），跟我們熒光染料的波長做匹配（見下表），我們提供的是最佳波長，在該波長下能夠得到很好的成像效果，但假如參數相差30nm，也是可以觀察到的；如果您確實無從得知具體的儀器參數，那也可以做一些近似波長匹配，比如您知道您的顯微鏡可以觀察FITC，那么對應Absin多色染料近似是TSA520；如果您發現您儀器的個別通道也不在我們近似波長的清單中，比如Texas Red，那您可以查一些資料確認一下該染料的激發波長和發射波長（Texas Red EX/EM：570/600nm），再去對應Absin的染料參數，跟TSA620（EX/EM：590/620nm）比較近，激發和發射波長都在30nm范圍內，那么判斷該通道是可以觀察TSA620這個染料的。但染料近似匹配還是有可能存在觀察不了的情況，確認儀器參數是很精準的，如果最后發現染完色確實成像不了，也可以咨詢Absin掃片服務哦。

表1 Absin多色熒光染料波長對照表

表3 Absin多重熒光免疫組化全套解決方案