分子克隆技術(shù)——質(zhì)粒介紹篇

上期給大家介紹了分子克隆的概念、原理以及通用實驗流程，相信大家已經(jīng)對分子克隆技術(shù)應該有一定了解了，詳見 “分子克隆技術(shù)全攻略" 。本期小愛將為大家講解分子克隆的載體——質(zhì)粒。走！瞅瞅去! 

分子克隆技術(shù)運用的載體只要是指將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細胞的一種能自我復制的DNA分子工具。常見的載體主要有質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。今天咱們要聊的主角是質(zhì)粒。

一、什么是質(zhì)粒？

天然質(zhì)粒是可獨立于染色體外可自行復制的環(huán)狀DNA分子，通常帶有一些基因，特別是一些與抗生素耐藥性有關(guān)的基因，可以在不同的細菌細胞之間傳遞。質(zhì)粒主要存在于細胞、古生菌及真核生物中，比較特殊的在植物的葉綠體和線粒體等胞器中也有出現(xiàn)。

研究報道指出質(zhì)粒也不全是環(huán)狀的哦！1984年，在Streptomyces coelicoler（天藍色鏈霉菌）等放線菌以及在Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋體）等原核生物中，又相繼發(fā)現(xiàn)線形質(zhì)粒。基于質(zhì)粒能夠攜帶基因，并且能夠在不同細胞中傳代基因的特性，質(zhì)粒被運用到分子克隆技術(shù)中。在分子克隆技術(shù)中運用的質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應實驗室操作而進行人工改造得來，通常所用的是細菌載體質(zhì)粒。

它在分子克隆技術(shù)中的運用是將某種目標基因片段重組到質(zhì)粒中，構(gòu)成重組基因或重組體。將這種重組體經(jīng)微生物學的轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)入受體細胞（如大腸桿菌）中，使重組體中的目標基因在受體菌中得以繁殖或表達，從而改變寄主細胞原有的性狀或產(chǎn)生新的物質(zhì)。

細菌質(zhì)粒是基因工程中常用的載體，這些質(zhì)粒至少要有復制起點、篩選標記和克隆位點。基礎(chǔ)的部分我們都來詳細了解下。

二、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)原件有哪些？

圖1 質(zhì)粒圖譜

1）復制起始位點(Origin of Replication，ORI)

ORI是一段DNA序列，質(zhì)粒復制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于這段序列，然后DNA的雙鏈被分開，復制隨即開始。質(zhì)粒必須是能夠復制的，否則隨著細菌的生長，質(zhì)粒的數(shù)量將會被迅速稀釋。

2）抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Gene)

抗生素抗性基因存在作用是快速篩選。在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌，能夠生長的就是含有目的質(zhì)粒，不含質(zhì)粒的細菌已經(jīng)被“殺死"了。

3）篩選標記(Selectable Marker)

篩選已經(jīng)成功攝取質(zhì)粒的細胞。該篩選標記需要區(qū)別于細菌中的抗性篩選。細菌抗性基因篩選用于質(zhì)粒擴增過程，篩選標記用于篩選或標記轉(zhuǎn)染后的細胞。篩選標記通常是抗性篩選或者熒光蛋白。

4）啟動子(Promoter)

啟動子是能夠使基因進行轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動子可以被RNA聚合酶辨別，并開始轉(zhuǎn)錄。啟動子常位于目的基因上游100-1000bp位置處，是質(zhì)粒非常重要的一個元件，它決定著目的基因可以在何種細胞中進行表達，也決定蛋白質(zhì)的表達量。

5）多克隆位點(Multiple Cloning Site, MCS)

多克隆位點是一段短DNA片段，包括多個限制性酶切的單一位點，便于外源基因的插入。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。在表達型質(zhì)粒中，MCS常處于啟動子的后面。

6）引物結(jié)合位點(Primer Binding Site)

引物結(jié)合位點為一小段DNA片段，用來進行質(zhì)粒的PCR擴增或者測序。

7）插入片段(Inserted Gene)

插入片段又稱為外源性基因，是克隆到MCS中的基因、啟動子或其他DNA片段，通常是人們所希望研究的遺傳元件。

三、質(zhì)粒的分類有哪些？

1）表達質(zhì)粒：用于基因表達（基因功能的研究）。表達載體必須包含啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子序列和插入基因。啟動子驅(qū)動插入DNA轉(zhuǎn)錄生成RNA，合成的RNA上的終止子序列發(fā)出停止轉(zhuǎn)錄過程的信號。表達載體可以通過增強子序列增加蛋白質(zhì)或RNA的產(chǎn)量。表達載體可以在各種細胞類型（哺乳動物、酵母、細菌等）中驅(qū)動表達，這在很大程度上取決于用于啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子。

2）克隆質(zhì)粒：用于促進DNA片段的克隆。克隆載體往往非常簡單，通常只包含細菌抗性基因、復制起點和MCS。

3）報告質(zhì)粒：用于研究遺傳元件的功能。這些質(zhì)粒包含一個報告基因（例如，熒光素酶或GFP），可提供遺傳元件活性的讀數(shù)。愛必信的快速多片段DNA組裝預混液（abs60250）可以直接用于報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建。同時我們還有一系列的熒光素酶報告基因檢測試劑盒：abs60341、abs60342、abs60343、abs60344供大家選擇。

4）病毒質(zhì)粒：通過修飾的病毒基因組，有效地將遺傳物質(zhì)遞送到靶細胞中。可以使用這些質(zhì)粒來制造病毒顆粒，例如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、AAV或腺病毒顆粒，從而高效感染靶細胞。

5）基因敲減質(zhì)粒：用于減少內(nèi)源基因的表達。通過表達靶向目的基因mRNA的shRNA來實現(xiàn)。這些質(zhì)粒具有可以驅(qū)動短 RNA 表達的啟動子。

6）基因工程質(zhì)粒：用于靶向和編輯基因組。通常使用CRISPR技術(shù)完成。

表1 本期小愛推薦產(chǎn)品

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預染marker、預制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體；定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...