mRNA質量檢測之poly A尾檢測方法

首先我們需要先回顧下3’端polyA尾的功能：保護帽結構不被降解，與polyA結合蛋白、5’ Cap（帽結構）和翻譯起始因子蛋白協同作用，啟動蛋白質的翻譯。多數mRNA的polyA長度為50–200 nt，以維持正常的生物學功能。polyA尾的有無與長度是mRNA藥物的關鍵質量屬性之一。

當前polyA尾的檢測分為兩種思路：

① 與加帽率的分析策略類似，酶切后純化回收3’端polyA尾，隨后通過毛細管電泳（CE）、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、高效液相色譜（HPLC）或液相色譜質譜聯用（LC-MS），對polyA尾進行定性和定量分析。

② 基于二代或三代測序技術表征polyA，已報道的測序方法包括TAIL-seq、PAL-seq、FLAM-Seq和PAIso-Seq等。

2018年諾華公司Beverly M等發表在Anal Bioanal Chem雜志的一篇文章，《Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS》，研究基于RNAse T1酶切與oligo dT磁珠純化得到polyA尾，使用液相色譜質譜聯用（LC-MS）檢測polyA尾長度的分布，目前該策略是當前mRNA體外制備工藝中較為常用的方法。

2022年Brouze A等發表在Wiley Interdiscip Rev RNA期刊的一篇綜述，《Measuring the tail: Methods for poly(A) tail profiling》，總結了利用二代（Illumina）或三代（PacBio）測序與RNA直接測序平臺檢測polyA尾，可在分析polyA長度分布的同時表征序列的完整性和準確性。

1）mRNA樣品制備

一步法加尾：設計模板序列，包括不同長度polyA尾（27-112 nt），體外轉錄（IVT）制備mRNA樣品。

酶法加尾：模板序列不包括polyA，使用大腸桿菌來源的polyA聚合酶進行mRNA的加尾修飾。制備得到的mRNA進行瓊脂糖凝膠電泳，確認mRNA樣品的長度和完整性。以10 nt和20 nt 的polyA為標準品。

2）RNAse T1酶切與磁珠純化

① 酶切：內切酶RNAse T1可特異性地在單鏈RNA的鳥嘌呤核糖核苷酸（G）后進行切割。100 pmol mRNA加熱至95℃后迅速降至25℃，隨后加入10×RNase H緩沖液、2 μl RNase T1酶（100 μl體系），37℃孵育3小時。

② 純化：通過polyA尾與oligo dT磁珠特異性結合進行純化，使用0.1 M醋酸銨溶液清洗磁珠，隨后加入75%甲醇，80℃孵育1 min，洗脫polyA片段。③換液：通過旋轉蒸發去除甲醇，重懸于含1%甲醇的0.1 mM EDTA溶液，用于LC-MS分析。

3）LC-MS分析

使用高分辨液相質譜聯用儀，固定相為ACQUITY C18色譜柱，流動相A為200 mM六氟異丙醇+8.15 mM三乙胺（pH 7.9），流動相B為100%MeOH。

洗脫條件為：5%B洗脫1min，1-12 min內B濃度由5%線性增加到25%，然后90%B沖洗1min后恢復5%B。紫外波長設置為260 nm。

4）不同加尾方法得到的polyA尾長度評估

與利用質粒模板轉錄生成polyA相比，酶法加尾的mRNA樣品的出峰更寬，polyA尾長度的分散性更大。

圖1 不同加尾方法得到的polyA尾分布（離子色譜圖）

5）HPLC與MS的分辨率

當polyA長度為27 nt時，高效液相色譜（HPLC）可有效分離相差一個腺苷的polyA，但當堿基個數增加至64或100，HPLC未能有效分離相差一個腺苷的polyA（圖2a）。而質譜（MS）可彌補這一缺陷，當polyA長度為100 nt，電噴霧質譜圖可精確檢測任一不同分子量的polyA（即不同長度的polyA），通過峰強度對polyA長度分布進行相對定量（圖2b）。

如上所述，文章介紹了一種分析mRNA polyA尾長的方法。該方法基于RNase T1將polyA從mRNA序列上切割下來，通過dT磁珠特異性捕獲polyA，然后借助LC-MS的高分辨率，定量分析mRNA的polyA尾長度分布。

基于該策略的可替代方法包括：根據核苷酸序列特性，使用其他RNA酶（如RNase A或RNase H）代替RNase T1，以獲得polyA片段，隨后通過毛細管電泳、HPLC對短核苷酸進行分離與定量分析。

有研究報道，可利用Illumina二代測序、PacBio三代測序與納米孔RNA直接測序平臺分析polyA，測序原理及流程如下：

1）基于Illumina平臺分析polyA尾

Illumina RNA-Seq的原理是通過富集mRNA（polyA富集）或去除rRNA，產生片段化的RNA序列，然后將RNA逆轉錄生成雙鏈cDNA，在片段末尾加入測序接頭后進行PCR擴增。cDNA分子聚集在流動池，通過DNA合成體系中的3’端熒光標記的核苷酸底物讀取熒光信號，從一端（單端測序）或兩端（成對末端測序）進行測序。

常用的方法包括TAIL-Seq和PAL-Seq，借助于制備完整的包括polyA尾在內的3’端mRNA測序文庫。首先將RNA與生物素化的3’端DNA接頭連接，并用RNase T1部分酶切，留下完整的polyA尾，隨后使用鏈霉親和素磁珠捕獲3’端片段。通過凝膠電泳篩選不同條帶，并與5’端接頭連接，為逆轉錄、文庫擴增和測序提供完整的模板。如圖3所示，PAL-Seq和TAIL-Seq的不同在于DNA接頭，TAIL-Seq僅存在一個單鏈DNA接頭，測序過程需去除rRNA。而PAL-Seq技術除單鏈DNA接頭外，還存在一端與polyA尾和3’端接頭互補的DNA寡核苷酸序列，提高了連接效率，因此不需去除rRNA。

Illumina測序技術的不足在于，由于polyA的長多聚物特性，容易產生PCR擴增的偏倚，保真度較低，序列準確性較低。

圖3 基于Illumina平臺的polyA尾測序方法

2）基于PacBio平臺分析PolyA尾

不同于Illumina短cDNA片段合成測序的方法，PacBio采用單分子實時測序技術，在處理均聚物的效果優于Illumina，可對全長RNA分子進行測序，提供有關polyA的長度和序列信息。

常用方法包括FLAM-Seq和PAIso-Seq。如圖4所示，兩種方案的主要步驟是3’端延伸、逆轉錄、cDNA擴增、環狀接頭連接和PacBio測序。

二者的不同點為：

FLAM-Seq首先選擇帶有polyA尾的mRNA，隨后對其進行G/I加尾。逆轉錄引物由5’末端的PCR handle組成，然后在模板置換寡核苷酸（TSO）的情況下合成第二鏈，最后將合成的雙鏈cDNA擴增并進行PacBio測序。而PAIso-Seq首先與oligo dT結合，3’末端延伸，經USER降解oligo dT寡核苷酸，隨后經逆轉錄、PCR擴增雙鏈cDNA并進行PacBio測序。PacBio具備均聚物測序能力，可用于分析polyA尾的序列組成。

圖4 基于PacBio平臺的polyA尾測序方法

3）基于納米孔RNA直接測序平臺分析polyA尾

納米孔RNA直接測序平臺由Oxford NanoporeTechnologies（ONT）推出，與二代、三代測序相比，納米孔RNA直接測序技術分析polyA尾不需進行PCR，流程如圖5所示，將3’端接頭連接至mRNA（含polyA），逆轉錄（可選操作）后連接至3’端測序接頭（與動力蛋白連接），隨后被加載到納米孔形成的流動池，施加電壓后，在動力蛋白驅動下，RNA由3’端至5’端通過納米孔，根據特異性電流信號分辨堿基序列。納米孔RNA直接測序平臺不需切斷mRNA序列，直接讀取全長序列；該平臺不依賴于逆轉錄和PCR反應，可以同時表征序列的完整性、準確性和核苷酸修飾。

圖5 基于納米孔RNA直接測序平臺的polyA尾檢測方法

2018年Beverly M等使用內切酶RNase T1進行特異性切割，利用磁珠分離得到5’端polyA尾，隨后通過LC-MS有效分離不同分子量大小的核苷酸序列，從而定量分析polyA尾長度分布。該方法是體外合成mRNA polyA尾的常用表征方法。

隨著測序技術的發展，科學家們開始基于測序平臺分析polyA尾長度。基于Illumina平臺的TAIL-Seq和PAL-Seq技術，以及第三代測序技術PacBio平臺，通過構建cDNA文庫對polyA尾或全長mRNA進行測序，可檢測polyA尾長度和序列完整性。但二者均依賴于PCR擴增cDNA，長均聚物的存在導致PCR擴增不可避免地存在偏差，可能對polyA尾長和序列準確性造成影響。ONT開發的直接測序方法，不依賴于逆轉錄與PCR擴增，可以實現polyA尾部長度及序列準確性的檢測，不存在PCR偏倚性。然而以TAILseq、PALseq、FLAMseq、PATseq及納米孔測序為代表的測序技術通量大、設備要求高，鑒于體外合成的mRNA通量較小，無法體現測序技術的高通量優勢。

[1] Beverly M, Hagen C, Slack O. Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2018 Feb;410(6):1667-1677. doi: 10.1007/s00216-017-0840-6.

[2] Brouze A, Krawczyk PS, Dziembowski A, et al. Measuring the tail: Methods for poly(A) tail profiling. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2022 May 26:e1737. doi: 10.1002/wrna.1737.

[3] 藥品審評中心. SARS-CoV-2預防用mRNA疫苗藥學研究技術指導原則（試行）. 2020.

[4] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022.

轉自耀海生物

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