WB專欄——好的樣本制備是實驗成功的一半

一、蛋白提取 

樣本制備是WB實驗的第一步也是最重要的一步，它的操作雖然并不復雜，卻有很多需要注意的細節。

根據實驗需要的目標蛋白的不同，大致可以分為三種：總蛋白、膜蛋白和核蛋白。總蛋白提取顧名思義就是把組織或細胞內所有的蛋白全都提取出來；膜蛋白、核蛋白提取簡單來說就是把細胞膜、細胞核上的蛋白質提取出來。

提取流程概覽

不同部位的蛋白要能夠提取分離，需要用到不同的提取試劑，看起來十分麻煩，愛必信的蛋白抽提試劑盒（abs9346）提供了一種比較簡單、方便的從培養細胞或新鮮組織中抽提細胞核蛋白、細胞漿蛋白、細胞膜蛋白與細胞骨架蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養細胞的細胞漿蛋白、細胞核蛋白、細胞膜蛋白與細胞骨架蛋白的分離。

二、常見問題&解決策略

Q1 蛋白信號弱甚至無信號

在應用裂解液進行裂解的時候，除了釋放出目標蛋白，也同時釋放出一些酶，這些酶可能會降解我們的目標蛋白，所以需要對這部分酶進行降解。

添加合適的蛋白酶抑制劑（abs9161）或磷酸酶抑制劑（abs9162），全程低溫操作，提前預冷PBS（abs961）、裂解液甚至槍頭等，從收集細胞開始一直到煮樣的全過程都應該盡可能的保持在冰上操作。

蛋白酶/磷酸酶抑制劑推薦

如果實驗過程中需要這部分酶和一些小分子蛋白，在選擇裂解液的時候也要選擇沒有抑制劑的裂解液（abs9231和abs9239）

樣品中不含待測蛋白，有太多可能性，對蛋白定位不準確，采用了錯誤的提取方法。

找準蛋白定位，是否需要保留蛋白的天然結構，如果需要的話在選擇裂解液的時候要選擇不含去垢劑或者含少量Triton-X-100的裂解液（abs9230）；不需要的話可能是RIPA試劑的濃度沒有調配好，或者選擇了不合適強度的RIPA。

常規裂解液對比表

如果您覺得裂解液的選擇太麻煩，愛必信為您精心準備了免疫印跡及免疫沉淀用裂解液（abs9116，abs9239），這兩款產品的濃度是經過大量的實驗驗證調配出的最佳濃度，幾乎適用于90%的樣本制備，讓您的樣本制作更輕松。

裂解液推薦

* 樣品蛋白含量低

* 去除高豐度蛋白，富集低豐度目的蛋白

Q2、蛋白成坨吸不上來，電泳條帶形狀不好

SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高

①再煮5min。常規煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；
②如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當增加SDS LB，繼續煮；
③也可以對樣品進行超聲。

煮樣不能過久，容易造成蛋白凝固，出現沉淀和水分離，只能丟棄。

Q3、出現多帶現象

* 細胞傳代次數過多，使其蛋白表達不同    
* 使用原始未傳代的細胞株，做對照實驗
* 蛋白具有多種修飾形式，可能存在糖基化、磷酸化、羥基化
* 去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾
* 蛋白樣本降解        
* 加抑制劑、冰上操作

蛋白樣品的制備是整個WB實驗最初的一步也是最關鍵的一步，選對試劑找對方法至關重要，愛必信將不斷探索與開發優良的試劑，為您的實驗保駕護航。