大鼠骨髓間充質干細胞體外 CFSE 染色標記的實驗研究

骨髓間充質干細胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種位于骨髓微環境、具有多 向分化潛能的成體干細胞。因其取材方便簡單、能 在體外大量擴增、可自體移植避免免疫排斥和倫理 問題，已成為理想的組織工程種子細胞和基因治療 的靶細胞。文獻報道，MSCs 移植可用于治療正 己烷中毒導致的周圍神經。BMSCs 如應用于 組織工程和基因治療，首先需要解決的問題之一是 如何高效、安全地標記 BMSCs，進而跟蹤其在體內 的歸巢、分化、存活等系列過程。

羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5，6 － carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)是 一種可穿過細胞膜、與細胞內氨基不可逆結合的熒 光染料，因其標記效率高、容易檢測、無放射性而逐 漸得到廣泛應用。本研究將 CFSE 用于 BMSCs 的體外標記，并探討其最佳標記濃度和最佳標記時 間，旨在探索建立體外 BMSCs 的 CFSE 標記方法，為 BMSCs 的移植研究提供實驗基礎。

BMSCs 的 CFSE 標記

熒光顯微鏡下觀察可見，標記 CFSE 的 BMSCs 細胞膜、細胞質和細胞核都發出綠色熒光，整個細胞 呈綠色，細胞核的熒光強度最高。CFSE 標記的 BMSCs 仍保持良好的細胞形態，呈梭形或多角形。BMSCs 標記 CFSE 后進行 Hochest 33342 染 色，以計算 CFSE 標記率，結果顯示:CFSE 濃度為 2． 5 μmol /L、標記時間為 20 min 及以上時，標記率 基本為 100 % ;5 μmol /L 或 10 μmol /L 的 CFSE 標 記 15 min，細胞標記率即基本為 100 % ;CFSE 濃度 為 20 μmol /L 時，僅標記 5 min 就能使細胞幾乎 100% 標記;CFSE 濃度 ＞ 10 μmol /L，作用時間 ＞ 15 min 時，CFSE 的濃度和作用時間對標記率無明顯影 響(P ＞ 0． 05)。

CFSE 標記對 BMSCs 存活率的影響 
10 μmol /L CFSE 標記 BMSCs 的時間≤15 min 時，BMSCs 的存活率基本不受影響，但當標記時間 為 20 min 或 30 min 時，BMSCs 的存活率顯著下降 (P ＜ 0． 05)，僅分別為 92． 67 % 和 70． 33% 。 不同濃度 CFSE 標記對 BMSCs 存活率的影響結果顯 示，2． 5、5、10 μmol /L CFSE 標記 BMSCs 15 min 均不 影響細胞活性(P ＞ 0． 05)，20 μmol /L CFSE 標記 15 min 使 BMSCs 的存活率顯著下降為 87． 45 % 。

CFSE 是一種可標記活細胞的熒光染料，具有較 強的細胞膜通透性。CFSE 進入細胞后，其乙酸基團 可被細胞內酯酶水解去除，喪失膜通透性，而具有很 高的熒光活性，被激發將發生綠色熒光。此時的 CFSE 能與細胞骨架蛋白形成可激發熒光的蛋白復 合物，該復合物不能脫離細胞，且不會污染鄰近細 胞，使非標記細胞免受染料影響

本實驗證明， CFSE 標記 BMSCs 的細胞膜、細胞核及細胞質都帶 有綠色熒光，且標記細胞的形態不受影響。臺盼藍 結果顯示，CFSE 濃度 ＜ 20 μmol /L、標記時間 ＜ 20 min 時，BMSCs 的 存 活 率 均 未 受 影 響。Dumitriu 等報道，CFSE 標記細胞后不會引起細胞的凋亡 或壞死，而且細胞凋亡壞死后，標記的 CFSE 仍能穩 定地留存于細胞中且不影響凋亡和壞死的發生，以 上結果同時證明 CFSE 標記不影響細胞的生命活 動。但當 CFSE 標記濃度達到 20 μmol /L 或標記時 間 ＞ 20 min 時，BMSCs 的存活率將會降低，甚至部 分細胞出現死亡。故在 CFSE 對 BMSCs 標記率都達 到 100% 的前提下，本研究選擇 CFSE 較低的作用濃 度和較短的作用時間，即 10 μmol /L CFSE 標記 15 min，作為 CFSE 標記 BMSCs 的最佳條件，以在達到 CFSE 最佳標記效果的同時保持最佳的細胞活性。

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本文參考文獻: 
大鼠骨髓間充質干細胞體外 CFSE 染色標記的實驗研究 
陳若霖1 ，樸豐源1 ，李雙月1 ，王哲敏1 ，戚 媛1 ，劉 爽1 ，關 懷2 ，金河天3 (1． 大連醫科大學 勞動衛生與環境衛生學教研室，遼寧 大連 116044; 2．