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                抗原修復(fù)很重要,各種干貨快記牢!

                更新時(shí)間:2020-05-29      點(diǎn)擊次數(shù):2519

                做多了IHC實(shí)驗(yàn)的小伙伴,相信對(duì)于抗原修復(fù)都不陌生,這看似簡(jiǎn)單的一小步,往往會(huì)對(duì)IHC實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生顯著影響。愛必信作為您身邊的科研百寶箱,秉持著嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的態(tài)度,為您總結(jié)了一系列從修復(fù)緩沖液、煮沸裝置到修復(fù)方法,注意事項(xiàng)的小技巧,希望這些小細(xì)節(jié)能完善您的實(shí)驗(yàn),像愛必信一直堅(jiān)信的一樣,從小處入手,時(shí)刻陪伴您的科研生活,助力實(shí)驗(yàn)大成功。

                 

                抗原修復(fù)是針對(duì)石蠟包埋的切片的必要步驟,大多數(shù)甲醛固定的組織在開始染色前都要先修復(fù)抗原,這是由于在固定過程中產(chǎn)生了亞甲基橋使蛋白之間交聯(lián)屏蔽了抗原位點(diǎn)。常用的兩種方法為熱修復(fù)法(HIER)和酶解法。

                 

                一、熱修復(fù)法

                1. 熱修復(fù)緩沖液

                適用于HIER的緩沖液有多種,我們推薦兩種常用的緩沖液:pH 6.0,10mM檸檬酸鹽緩沖液和pH 8.0,0.5mM EDTA緩沖液。具體使用哪種緩沖液可以參考您的抗體說明書,通常來講,EDTA緩沖液適合多數(shù)磷酸化酪氨酸特異性抗體,而檸檬酸鹽緩沖液則適用于其他多數(shù)抗體。

                 

                愛必信為您提供高品質(zhì)的熱修復(fù)緩沖液:
                 

                  貨號(hào)  品名  規(guī)格
                   abs9132   Citrate Concentrated Solution   250ml
                   abs9133  EDTA, 0.5 M, pH 8.0   100ml
                   abs9147  Sodium Citrate, Dihydrate   500g/1kg


                2. 熱修復(fù)方法

                (1)、高壓蒸汽法

                ▲ 將合適的抗原修復(fù)緩沖液加入高壓鍋內(nèi),然后將鍋置于加熱板并開至功率,此時(shí)不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過程中,進(jìn)行脫蠟復(fù)水。
                ▲ 煮沸后,將玻片放入高壓鍋,蓋緊蓋子,小心燙傷。
                ▲ 高壓鍋達(dá)到壓力后,維持3分鐘。
                ▲ 3分鐘后,關(guān)掉加熱板,將高壓鍋取下放置。
                ▲ 釋放蒸汽,冷水冷卻鍋身。壓力下降后打開鍋蓋,冷水冷卻10分鐘。小心燙傷,修復(fù)完畢。

                 

                注意事項(xiàng):

                ● 3分鐘只是建議時(shí)間,并不是所有抗原的修復(fù)時(shí)間,可以設(shè)置對(duì)照試驗(yàn),分別設(shè)定1、2、3、4……分鐘進(jìn)行探索,確定修復(fù)時(shí)間。
                ● 確保玻片*冷卻再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

                 

                (2)、微波法

                微波法不要使用家用微波爐,沒有高壓環(huán)境,修復(fù)時(shí)間長(zhǎng),會(huì)使切片解離。請(qǐng)使用科研微波爐。

                向微波爐容器中加入合適的修復(fù)緩沖液
                ▲ 將玻片放入容器,置于微波爐內(nèi)。將溫度設(shè)置在98℃維持20分鐘以修復(fù)抗原
                ▲ 20分鐘后,取出容器放置于水中冷卻10分鐘,小心燙傷,修復(fù)完畢。

                 

                注意事項(xiàng):

                ● 要確保修復(fù)緩沖液足以浸沒玻片幾厘米,防止煮沸過程中變干。
                ● 20分鐘同樣也是建議修復(fù)時(shí)間,可設(shè)置對(duì)照試驗(yàn),自行探究修復(fù)時(shí)間。
                ● 確保玻片*冷卻。

                 

                 

                二、酶解修復(fù)法

                可依據(jù)抗體說明書選擇需要的酶,如果沒有,胰蛋白酶適用于大多數(shù)福爾馬林/PFA固定后需要修復(fù)的抗原。常使用的酶解修復(fù)方法有滴管法和浸泡法。

                 

                愛必信為您提供高品質(zhì)的蛋白酶:
                 

                  貨號(hào)  品名  規(guī)格
                   abs9145   胃酶Pepsin(1:3000)   50g/100g
                   abs9118  蛋白酶K   100mg/1g
                   abs47047375  胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) 不含酚紅   100ml


                (1)、滴管法

                ▲ 將胰蛋白酶預(yù)熱至37℃。小心的將組織切片周圍的水吸干,然后吸取酶溶液滴加到切片上(一般50-100ul)。用吸管將酶溶液鋪蓋住整個(gè)切片,注意不要弄壞組織

                ▲ 將玻片置于加濕器,然后37℃孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上,否則會(huì)因溫度不均影響染色質(zhì)量。▲ 盛放玻片的容器先預(yù)熱再放入恒溫箱內(nèi)。

                ▲ 10-20分鐘后,取出玻片,流水沖洗3分鐘。修復(fù)完畢。

                 

                (2)、浸泡法

                將水浴溫度設(shè)置為酶適宜溫度。向盛放玻片架的兩個(gè)容器中加入超純水。容器放入水浴加熱。
                ▲ 將玻片放入水浴箱其中一個(gè)容器加熱
                ▲ 用水浴箱中另一個(gè)容器中的熱水制備抗原修復(fù)緩沖液,然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。
                ▲ 將加熱過的玻片放入酶溶液中10-20分鐘并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘,將酶漂洗干凈。

                 

                注意事項(xiàng):

                有些酶需要特殊緩沖溶液和活性輔助因子。
                ● 水或緩沖液體積要足夠沒過玻片
                ● 若將冷玻片直接放入酶溶液中會(huì)使溶液溫度降低從而酶活性降低,導(dǎo)致抗原位點(diǎn)修復(fù)不*。
                ● 盡可能快的準(zhǔn)備出抗原修復(fù)緩沖液以避免妨礙酶活性的發(fā)揮。放入玻片之前使溶液達(dá)到需要的溫度。
                ● 10-20分鐘只是建議孵育實(shí)驗(yàn)。可自行設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)探究孵育時(shí)間。

                 

                 

                Absin特色產(chǎn)品線:
                WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動(dòng)劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

                 

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