凋亡檢測不會做？常用方法大總結

細胞凋亡檢測在生物醫學實驗中應用廣泛，不僅在多種疾病機制探究中要用到，更是可能在癌癥治療領域有所突破，今天小編總結了幾種常見的凋亡檢測方法，來看看有沒有你需要的吧：
 

一、細胞凋亡的形態學檢測

1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡

（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，全面皺縮，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。　　

（2） 染色細胞：

姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常細胞核色澤均一；凋亡細胞染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態；壞死細胞染色淺或沒染上顏色。

蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失。

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜內側，但在細胞凋亡早期，PS可從細胞膜內側翻轉到細胞膜表面，暴露在細胞外環境中。磷脂酰絲氨酸的轉位發生在凋亡早期階段，先于細胞核的改變、DNA斷裂、細胞膜起泡。體內的吞噬細胞可通過識別磷脂酰絲氨酸來清除凋亡細胞。Annexin-V（green）是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合，細胞處于調亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期壞死細胞可能為陰性），是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

PI和Annexin-V雙標：

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。
*注意：細胞凋亡時其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。

活細胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右圖左下象限）。早期凋亡細胞因磷脂酰絲氨酸的暴露及具有完整細胞膜，故呈Annexin V-FITC染色陽性及PI染色陰性（右圖右下象限）。壞死或晚期凋亡的細胞呈Annexin V-FITC及PI染色雙陽性（右圖右上象限）
*注意：未處理的對照細胞進行常規培養的過程中也有一小部分的細胞死亡發生。

三、線粒體膜電位的檢測

線粒體跨膜電位下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。

注意事項　　

1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。　　
2． 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四、DNA檢測　　

細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理后，采用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。　　

1.大分子染色體DNA測定片段

細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。　　

2.DNA Ladder 測定
3.凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析　　
4.ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優點：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

五、 TUNEL法　　

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

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