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                免疫組化染色全是一片紅原因分析

                更新時間:2020-03-20      點擊次數:3864

                我們做實驗的時候,會發現做免疫組化整張片子染的臟臟的一片紅的情況,而這其中有很多原因。以下是對免疫組化一片紅的總結:

                 

                1. 抗體用了多抗?

                一抗用多抗很容易出現非特異性染色,建議用高純度的針對更具特異性抗原決定簇的單抗來解決。單抗很貴,不過效果很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成悲劇,所以要注意抗體的有效期。

                 

                1. 抗體濃度過高/孵育時間過長

                一抗濃度太高也是出現非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預實驗。每次使用新抗體前應該多做預實驗,摸索出理想的工作濃度,不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后,立刻調好定時器,提醒自己及時終止反應,就會避免這個問題。

                 

                1. DAB染色時間太長/變質

                DAB的孵育時間過長,會造成背景非特異性染色。DAB的顯色時間不是一成不變的,主要靠自己在顯微鏡下盯著,一旦出現淺淺的棕色的時候,就要馬上沖洗。出現棕色的時間過短,表明抗體濃度過高;出現棕色的時間過長,表明抗體濃度過低。DAB要保存于避光干燥的地方,現用現配,臨用前才加入H2O2。

                 

                1. 內源性酶和生物素

                內源性酶和生物素也會造成非特異性染色,特別是一些內源性酶生物素含量豐富的組織,如肝臟,腎臟,脾臟等。處理的辦法為:滅活堿性磷酸酶:常用的方法是將左旋咪唑(24 mg/mL)加入底物液中,并保持PH值在7.6-8.2,即能除去大部分內源性堿性磷酸酶;對于酸性磷酸酶,可以用50 mmol/L的酒石酸抑制;對于內源性過氧化物酶,可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內源性生物素,染色前將切片浸于25 μg/mL親和素溶液中15分鐘,PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。

                 

                1. 組織變干

                一下子染太多片子的時候,容易出現這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織,超出組織邊緣2 mm。然后用PAP筆在組織周圍畫一個圈圈,把修復液圈在里面。避免修復液流走。圈圈應該距離組織邊緣3-4 mm。

                 

                1. 浸泡時間過長

                切片在緩沖液或修復液里面浸泡過一夜,也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。獨門秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里,過一夜*沒有問題。

                 

                1. 清洗不充分

                清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配,用之前再次測PH值。緩沖液用0.05 mol/L的Tris-HCL,0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一點去垢劑Tween-20就更好了。

                 

                1. 封閉血清問題

                是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動物的非免疫血清,例如二抗是羊抗兔,就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片,37°C 10-30分鐘。這里不用洗,直接甩掉即可。在這再貢獻一個獨門絕招,直接用奶粉也可以。用5%的脫脂奶粉就可以了。而且效果還不錯。怎么樣?簡單吧。

                 

                免疫組化是個苦活臟活。步驟多,時間長,還要接觸有毒有害的物質。要是好好的一張片子染出來都是全國江山一片紅就得不償失了。

                 

                以上呢就是我們今天想給大家分享的內容,那這么多的注意事項,對于新手來說,有沒有更為簡便的方案呢

                劃重點啦~absin生物可以提供即用型的免疫組化二抗試劑盒,包含從封閉到顯色的所有試劑(不包含一抗),基于聚合物技術的新一代免疫組化二抗非生物素檢測系統,信號更強、操作更加簡單。適合大量做組化實驗或者新手客戶。

                 

                 

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                實驗步驟  推薦指數  貨號  產品名稱  規格  分類
                樣本制備   abs9134  Formaldehyde  25ml,500ml,1L,4L  固定液
                  ★★★★★  abs9179  4%多聚甲醛/通用型組織固定液  500ml  固定液
                  ★★★  abs9131  Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate  5g,100g  處理玻片防脫片
                  ★★★  abs9172  Poly-D-lysine (Mw 150,000-300,000)  25mg  處理玻片防脫片
                  ★★★  abs9135  Gelatin  100g,500g  處理玻片防脫片
                輔助試劑    abs9256  10×TBS  500ml  緩沖液
                    abs952  10*TBST  100ml,1L  緩沖液
                    abs961  10×PBS緩沖液  500ml,500ml*10  緩沖液
                    abs962  1×PBS緩沖液  500ml,500ml*10  緩沖液
                    abs9149  Triton X-100/曲拉通X-100  100ml,500ml  緩沖液
                抗原修復    abs9145  Pepsin(1:3000)  50g,100g  抗原修復液
                    abs9118  Proteinase K  100mg,1g  抗原修復液
                  ★★★  abs9247  EDTA抗原修復液(50×)  100ml  抗原修復液
                  ★★★  abs9207  冰凍切片快速抗原修復液(5×)  100ml  抗原修復液
                  ★★★  abs9249  檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液(40×)  100ml  抗原修復液
                  ★★★  abs9248  檸檬酸鈉抗原修復液(50×)  100ml  抗原修復液
                  ★★★  abs9208  細胞爬片抗原修復液(1X)  100ml,500ml  抗原修復液
                封閉    abs933  Goat serum  10ml,50ml  封閉血清
                    abs936  Horse serum  200ml(2*100ml)  封閉血清
                    abs939  Normal Monkey serum  100ml  封閉血清
                    abs937  Normal mouse serum  100ml  封閉血清
                    abs946  Rabbit serum  10ml,50ml  封閉血清
                    abs947  Rat serum  100ml  封閉血清
                    abs935  The ass/donkey serum  10ml,50ml  封閉血清
                    abs9155  牛血清白蛋白(BSA)  50g,100g  封閉液
                抗體孵育  ★★★★★  abs957  即用型高效免疫組化二抗試劑盒  5ml  二抗試劑盒
                  ★★★★★  abs929  PAP Pen 組化筆  1支  組化筆
                顯色/復染  ★★★★★  abs9210  DAB 顯色試劑盒(棕黃色,IHC)  1kit  顯色試劑
                  ★★★  abs47047616  DAPI染色液  10ml,50ml  熒光染料
                    abs9105  Propidium Iodide  5mg,10mg  熒光染料
                    abs9140  Methyl Green, 0.1% w/v aq. soln.  100ml  熒光染料
                    abs9142  Nuclear Fast Red  5g  熒光染料
                  ★★★★  abs9217  蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒  10g,25g  熒光染料
                封片    abs9177  中性樹膠(鏡檢用封片劑)  100ml  
                    abs9234  抗熒光淬滅封片液  5ml  
                    abs9235  抗熒光淬滅封片液(含DAPI)  5ml,25ml  
                    abs9236  抗熒光淬滅封片液(含PI)  1ml  

                 

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                二抗、標簽抗體、對照抗體;WB相關:ECL發光液、預染marker、預制膠;IHC相關:二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;細胞因子、信號通路調節劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒、呼吸爆發試劑盒;動植物提取物,定制服務(抗體/多肽/蛋白)...
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